苗药熏蒸验方对体外培养骨性关节炎家兔软骨组织的治疗作用及机制研究①

张 琪 王 琳 李田洋 郑曙光 贵州中医药大学贵阳550025

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是由多种因素引起的高发病率关节疾病,主要是骨、软骨及滑膜等代谢变化导致关节软骨结构炎症和破坏,甚至累及关节周围组织的全方位慢性退行性病变,其典型症状为关节肿痛、畸形、活动时出现磨擦声等,以膝关节受累最为常见,高发于女性及中老年患者[1-3]。OA发病机制复杂、起病隐匿、病程长、易复发、难痊愈,导致其致残率居高不下,损伤患者身心健康,降低患者生存质量。目前OA的病因及机制尚未明确,故尚无理想治疗方案。课题组在临床治疗及前期实验研究中发现,苗熏验方对关节软骨损伤性关节炎具有一定治疗作用,抗炎镇痛效果良好[4-6]。而在体外培养软骨组织的药效学研究尚未见报道,因此,本研究以碘乙酸钠诱导OA家兔模型,分离培养目标软骨组织块,苗熏验方水溶液培养,研究苗熏验方有效成分对家兔退行性关节软骨炎症因子、二型胶原蛋白(COL-Ⅱ)和基质金属蛋白酶的影响,探讨其防治关节软骨退变的可能机制,进一步验证苗熏验方缓解OA炎症疼痛的机制,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年新西兰大白兔36只,体重(2.0±0.2)kg,购自重庆腾鑫养殖公司,许可证号:SCXK(渝)2017-001。清洁级动物房饲养,室温下复合饲料喂养。

1.1.2 主要试剂与仪器 苗医熏蒸液组方由大血藤、小血藤、鸡血藤、透骨香、飞龙掌血、骨碎补、淫羊藿等12味药材组成,均购自贵州同济堂(按配方比例称取,以8倍水浸泡2 h,蒸馏冷凝提取药物有效成分50 ml,相当于生药药液3.6 g/ml,0.22μm微孔滤膜过滤,-20℃保存备用)；D-(+)-Glucosamine HCl(批号:G8240)购自北京索莱宝生物科技有限公司；Rabbit IL-1βELISA Kit(批号:JYM0011Rb)、Rabbit TNF-αELISA Kit(批号:JYM0003Rb)购自武汉基因美生物科技有限公司；Rabbit Anti-COL-Ⅱ(批号:bs-6319R)购自Bioss生物有限公司；酶标仪(型号:1510)购自赛默飞世尔有限公司；水平电泳仪(型号:JY300)购自君意东方电泳设备有限公司；PCR仪(型号:EDC-810)购自东胜创新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物造模、分组及给药 新西兰大白兔随机分为2组,正常组6只,模型组30只。以7.5 mg/kg剂量向双膝关节腔推注碘乙酸钠溶液复制膝骨OA模型[7]。造模成功后,取软骨组织,切取表层尺寸为3 mm×3 mm×1 mm的软骨组织块作为实验对象,分为模型组、阳性对照组、苗熏低、中、高剂量组,与正常组共同培养2 d和4 d,阳性对照组于完全培养液中稀释盐酸氨基葡萄糖为10 mmol/L,苗熏低、中、高剂量组于完全培养液中培养,稀释原冷凝蒸馏提取的苗熏药物原液培养,分别为360、720、1 440 mg/ml,于37℃、5%CO2培养箱内分别培养2 d和4 d。培养完成后采集软骨组织培养样品和培养上清液于-80℃待测。

1.2.2 ELISA检测软骨组织体外培养上清液IL-1β、TNF-α水平 Trizol法提取软骨组织培养液,3 000 r/min离心20 min,取上清,ELISA测定IL-1β、TNF-α水平,按照试剂盒说明书操作。

1.2.3 实时荧光定量PCR法检测MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA在软骨组织中的表达 提取软骨组织总RNA。当OD260/OD280值为1.8～2.0时,根据逆转录试剂盒说明书逆转录为RNA,根据RT-PCR扩增试剂盒说明检测mRNA水平,2-ΔΔCt法计算。引物序列见表1。

1.2.4 Western blot检测软骨组织COL-Ⅱ蛋白表达 在剪碎的组织块中加入RAPI裂解液裂解,充分匀浆,冰上裂解,离心收集上清,BCA定量法测定蛋白浓度,沸水中变性,取40μg上样,凝胶电泳,转膜,封闭,浸泡于COL-Ⅱ抗体(1∶2 000)孵育液中4℃孵育过夜,加入二抗(1∶50 000)室温孵育,ECL显色。

1.3 统计学处理 采用SPSS24.0软件进行数据分析,正态分布的计量数据以表示,统计分析前进行正态性及方差齐性检验,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 家兔软骨组织培养上清IL-1β、TNF-α水平相同培养时间,与正常组相比,模型组IL-1β、TNF-α水平明显上调(P＜0.05),与模型组相比,苗熏验方低、中、高剂量组及阳性对照组IL-1β、TNF-α水平明显下调(P＜0.05),相同组不同培养时间差异无统计学意义(P＞0.05,表2)。提示苗药熏蒸验方可降低OA软骨组织炎症因子IL-1β、TNF-α水平,抑制软骨基质降解,修复软骨组织。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 培养上清中IL-1β、TNF-α表达(，ng/L)Tab.2 Expressions of IL-1βand TNF-αin culture supernatant(，ng/L)

表2 培养上清中IL-1β、TNF-α表达(，ng/L)Tab.2 Expressions of IL-1βand TNF-αin culture supernatant(，ng/L)

Note:Compared with Normal group,1)P＜0.05；compared with Model group,2)P＜0.05.

Groups IL-1β TNF-α 2 d 4 d Normal 17.10±0.63 16.96±0.67 6.31±0.59 6.98 2 d 4 d±0.19 Model 28.57±1.561) 26.29±0.751) 13.47±0.501) 13.13±1.181)Positive 23.99±0.732) 22.71±0.652) 10.99±0.802) 10.57±0.542)Low-dose 24.23±0.522) 23.31±0.242) 11.73±0.272) 11.46±0.572)Mid-dose 20.81±0.442) 20.83±0.682) 10.45±0.442) 9.99±0.372)High-dose 19.19±0.642) 17.74±1.132) 9.15±0.402) 8.53±1.42)

图1 软骨组织MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达Fig.1 Expressions of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 mRNA in cartilage

图2 软骨组织COL-Ⅱ蛋白表达Fig.2 Expression of COL-Ⅱprotein in cartilage

2.2 家兔软骨组织MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达 相同培养时间中,与正常组相比,模型组MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达显著升高(P＜0.05),与模型组相比,苗熏验方低、中、高剂量组及阳性对照组MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表达显著降低(P＜0.05),相同组不同培养时间差异无统计学意义(P＞0.05,图1)。提示苗药熏蒸验方可能通过调节MMPs mRNA表达改善关节软骨病理状态。

2.3 家兔软骨组织COL-Ⅱ蛋白表达 相同培养时间中,与正常组相比,模型组COL-Ⅱ蛋白表达明显降低(P＜0.05),与模型组相比,苗熏验方低、中、高剂量组及阳性对照组COL-Ⅱ蛋白表达明显上升(P＜0.05),相同组不同培养时间差异无统计学意义(P＞0.05,图2)。提示苗药熏蒸验方可能通过上调凋亡相关蛋白表达发挥抗炎镇痛作用。

3 讨论

OA作为临床常见慢性炎症性疾病,以关节腔内慢性炎症和软骨组织损伤为主要病理特征。研究显示,SDF-1/CXCR4结合参与多种炎症性疾病及炎症调节,信号传导途径诱导蛋白水解酶释放,上调炎症细胞因子表达,导致软骨分解合成代谢失衡,细胞外基质破坏,炎症反应发生[8-9]。苗药熏蒸验方为按照苗医理论方剂收集的民间验方,在黔南、黔东南地区长期应用于OA、股骨头坏死等骨科疾病,方法独特,简便易行,疗效确切,毒副作用较小,含有藤本类植物,苗医理论认为此类植物长而薄的分布与人体肌肉和筋脉相似,且具有通气除风散血和舒筋通脉活络作用[10]；透骨香有祛风除湿、理气散寒止痛、活血通络之功效；淫羊藿、骨碎补温阳散寒,壮骨通痹,合用既能排毒、抗炎镇痛,还可通筋脉,补气、血,临床常用于治疗OA、股骨头坏死、皮肤病等疾病,疗效显著[11]。前期研究发现,苗熏疗法可有效抑制OA兔软骨中炎症因子蛋白表达,同时抑制OA软骨细胞凋亡,延缓OA病理进程,改善软骨病变。提示苗药熏蒸疗法对OA家兔具有一定治疗作用,但具体作用机制尚未明确[12]。苗熏验方曾作为临床经验方剂通过外用熏蒸疗法直接用于临床治疗,将药疗及热疗相结合,针对早期股骨头坏死临床治疗效果显著,且优于常规药物治疗对照组,疗效确切、用药安全,可明显缓解关节肿痛,改善功能障碍等临床症状和体征,提高患者生存质量,并具有简、便、廉、验等特点[6]。课题组前期已进行了较为系统的苗医理论和验方的调查整理工作,并进行了动物实验和临床研究,苗医熏蒸疗法不仅可改善实验动物局部血液循环、降脂、改善骨组织结构,而还可改善临床症状,缩短病程。

本研究采用关节腔注射碘乙酸钠法复制OA家兔模型,检测不同剂量苗药熏蒸验方水溶液对体外培养OA家兔关节软骨组织炎症因子水平的影响,结果表明苗熏验方有效成分可显著降低以活化单核巨噬细胞为主的促炎因子IL-1β和TNF-α水平。TNF-α与IL-1β存在协同作用,TNF-α不仅可破坏软骨细胞,还可促进IL-1β分泌,放大炎症反应,加重软骨组织损伤。研究显示,人或动物OA模型中IL-1β、TNF-α水平均明显提高[13-14]。因此,本研究结果表明苗药熏蒸验方可通过减少IL-1β、TNF-α分泌抑制OA家兔软骨组织损伤。

关节软骨主要由软骨细胞及周围细胞外基质构成,细胞外基质主要由胶原蛋白和蛋白多糖组成。其中COL-Ⅱ占胶原蛋白90%以上,是关节软骨的主要胶原成分,维持软骨表型结构和细胞功能,为软骨细胞外基质提供支架及弹性。当软骨退化速度远快于合成速度时,意味着软骨细胞分泌大量水解酶,基质金属蛋白酶(MMP)是软骨细胞外基质中最重要的蛋白水解酶之一,是一类锌离子依赖性肽链内切酶,直接参与软骨细胞转移、代谢和凋亡,促进基质蛋白和胶原降解,导致关节软骨纤维结构受损,引起关节软骨抗外力作用降低,从而导致软骨损伤,同时受IL-1β等炎症因子影响,介导软骨损伤。其中MMP-3具有强大的基质分解作用,可降解多型胶原,参与结缔组织重构；MMP-9多由炎症细胞分泌,具有促凋亡作用,参与细胞外基质合成和降解过程；MMP-13通过抑制成骨细胞分泌COL-Ⅱ发挥胶原降解作用。研究显示,MMP-3、MMP-9基因敲除小鼠OA得到明显改善[15-16],且体外通过TNF-α诱导软骨细胞并敲除MMP-3、MMP-13可明显抑制胶原蛋白和聚集蛋白聚糖降解。本研究进一步探讨苗药熏蒸验方对OA大鼠软骨组织中细胞外基质合成与降解蛋白表达的影响,表明苗药熏蒸验方可明显上调COL-Ⅱ蛋白表达,下调MMP-3、MMP-9、MMP-13基因表达,维持软骨基本结构。对比2 d和4 d的研究结果,药物干预组无明显差异,说明苗熏验方水溶液在软骨组织的治疗中具有稳定性,具有较高临床价值。

综上所述,苗药熏蒸验方可通过促进软骨细胞外基质合成,抑制细胞外基质降解,减少炎症因子分泌,进而抑制OA家兔软骨组织损伤,疗效确切,但远期疗效有待进一步研究。