温和灸对大鼠肌筋膜激痛点肌卫星细胞激活及成肌修复的影响❋

林业武，曹 磊，陈美雄，高彦平，袁仕国△

(1. 海南省中医院骨伤科, 海口 570203； 2. 海南省中医院麻醉科, 海口 570203； 3. 南方医科大学第三附属医院广东省骨科研究院, 广州 510630)

肌筋膜疼痛综合征通常由急性和慢性骨骼肌损伤引起，超过3/4的世界人口都受其影响，是最重要和常被忽视导致运动功能障碍的原因[1]。肌筋膜激痛点(myofascial trigger point, MTrP)是骨骼肌中紧张的带状组织中的过敏结节，是诊断和治疗肌筋膜疼痛综合征的关键点[2]。骨骼肌在各种原因形成MTrP后，由于持续疼痛使功能障碍、废用性萎缩，最终导致肌细胞萎缩、肌束纤维化，形成不可逆性病理改变。当肌肉出现严重纤维化时即表现为触诊中出现的条索和结节甚至发生钙化。骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cell, SMSC)又名成肌干细胞或骨骼肌干细胞，是骨骼肌损伤后修复的关键干细胞[3]。SMSC是骨骼肌组织内在的修复与维护系统，它通常是静止的，但在肌肉损伤或剧烈运动后开始激活并增殖，可进入分化程序，与受损的肌纤维融合或形成新肌纤维，或重新恢复静止的SMSC数量，或者分化为成纤维细胞等[4]。配对盒转录因子7(paired box gene 7, Pax7)是SMSC的标记性基因，对其活化、增殖、分化等均有重要影响。研究发现，静止的SMSC为Pax7阳性，而激活后开始逐渐丧失，成肌分化后则消失[5]。Pax7阳性是保持SMSC自我复制的关键标志[6]。艾灸作为中医的传统瑰宝，在治疗疼痛性疾病中发挥了巨大作用，并以其简便验廉优势在各个科室大量使用[7]，而温和灸是艾灸中最常用的方式。但艾灸治疗肌筋膜疼痛综合征作用机制缺乏研究。艾灸MTrP可促进局部炎症因子消退和成肌修复[8-9]，但对SMSC增殖分化等影响尚不清楚。故本项目拟探索温和灸对MTrP修复过程中成肌修复和SMSC的影响，旨在为温和灸治疗肌筋膜疼痛综合征提供深入的理论支持。本研究已通过南方医科大学实验动物伦理委员会审查，动物饲养和操作等符合科学和动物伦理规范，同时接受南方医科大学实验动物伦理委员会监督。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠30只，8周龄体质量(285.5±18.3)g，购自南方医科大学医学动物实验中心，实验动物许可证号SCXK(粤)20160041。温和灸纯艾绒艾条，北京同仁堂(亳州)饮片有限责任公司；XR-PT-10 A型动物实验跑台，上海欣软信息科技有限公司。根据文献自制打击器，主要部分为长度50 cm的木棒，木棒顶端加有重物，木棒及重物总质量1200 g，下端为钝头锥形，打击面积1 cm×1 cm，打击高度20 cm，动能2.352 J；BX-53型光学显微镜，日本Olympus公司；Pax7抗体(Polyclonal,AF7584)由Affinity Bioscience公司、二抗(keyFluor 488标记山羊抗兔IgG (H+L)，KGAB010)由keyGEN bioTECH提供。

1.2 大鼠分组

30只SD大鼠均分入正常组、模型组和温和灸组每组各10只。正常组不予任何干预，为空白对照组；模型组仅行MTrP造模；温和灸组行MTrP造模+温和灸干预。

1.3 大鼠干预

所有大鼠适应性饲养1 d然后开始造模干预。正常组常规饲养不予干预，模型组采用打击结合离心运动的方法建立MTrP模型。造模方法：用 10%的水合氯醛按3 ml/kg行腹腔麻醉，固定大鼠后在大鼠右股内侧肌中段偏近侧端做一打击位置标记，自制打击器的锥形钝头从20 cm高处落下，造成打击部位的骨骼肌损伤；第2天大鼠于倾角为-16°的电动跑台上进行持续性下坡跑训练，速度16 m/s，持续90 min，运动中使用声音和机械刺激驱赶，每周进行打击和跑台运动1次，连续4周，然后第31～60天正常饲养不予干预(具体方法参见文献[8, 10])。温和灸组进行MTrP造模+艾灸干预。MTrP造模同模型组，然后每次打击后第3天至第7天进行MTrP(打击部位)温和灸。操作如下：麻醉后固定，用定制的动物用细艾条(长20 cm,直径7 mm)点燃后，正对大鼠打击部位进行艾灸刺激30 min，将温度控制仪探头置于施灸穴位皮肤表面以监测实时温度，通过调节艾条与施灸穴位的距离在4～5 cm左右[11]，将施灸局部皮肤温度控制在(46 ℃±1℃)。MTrP打击后第3～7天温和灸，每日1次，连续5 d为1个疗程，共4个疗程。

1.4 MTrP取材及组织病理片制作

所有组别在第30天和第60天分别随机取5只大鼠，然后10%的水合氯醛按6 ml/kg用量腹腔注射过量麻醉处死大鼠。按文献方法取材，暴露股四头肌，用拇指和食指指腹轻轻按压探寻股四头肌，查找股内侧肌打击部位及周围的肌紧张带，可触摸及明显的紧张带和/或膨大的结节，并予以针灸针刺入此处，引出颤搐反应者即为MTrP[8]。正常组则在右侧股内侧肌相应的位置取材。标本以MTrP为中心，切取1 cm×1 cm×1 cm软组织块，用生理盐水漂洗2～3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm厚切片，脱蜡至水，常规HE染色，光镜下观察MTrP炎症细胞浸润、肌细胞扭曲、断裂、坏死、收缩结节、纤维化修复等病理形态。每个标本随机取5个切片，每个切片采集5个200倍视野图片，使用Image J软件分析肌细胞所占面积，最终取其均数。

1.5 MTrP组织中Pax7检测

采用免疫荧光法检测Pax7。上述石蜡切片脱蜡至水后采用0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 7.4) 60 ℃热抗原修复16 h，自然冷却至室温下。山羊血清37 ℃封闭15 min，滴加稀释比为1∶100兔抗大鼠Pax7一抗，4 ℃孵育16 h，PBS洗后滴加稀释比1∶200的keyFluor 488标记山羊抗兔二抗，4 ℃孵育1 h，其余常规操作。荧光显微镜下观测Pax7荧光强度，每个标本随机取5个切片，每个切片采集5个200倍视野图片，采用Image J分析Pax7荧光强度。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

所有大鼠无死亡，模型组、温和灸组大鼠无骨折、皮肤破溃、感染等。模型组2只、温和灸组1只大鼠血肿稍重，自行缓解，不影响后续实验。正常组较模型组、温和灸组大鼠活跃多动，各组饮食正常。

2.2 骨骼肌组织病理形态变化

光镜下观察可见，正常组骨骼肌肌细胞第30天和第60天均呈规则的多边形且排列正常，无坏死扭曲，间隙均衡，无明显炎症细胞浸润(见图1a、1b)。模型组在第30天可见肌细胞扭曲、萎缩、断裂，呈类圆形和不规则形，可见收缩结节，大量炎症细胞浸润；第60天少量炎症细胞浸润，但肌细胞仍呈类圆形或不规则形且萎缩、扭曲，收缩结节明显(见图1c、1 d)。温和灸组在第30天可见肌细胞扭曲、萎缩，细胞间隙增大，炎症细胞浸润，但均较模型组改善；第60天炎症细胞浸润已消失，肌细胞萎缩、扭曲明显改善，呈大小不等的多边形，少量收缩结节，肌细胞再生(见图1e、1f)。

图1 不同时间组别的骨骼肌HE染色

2.3 各组骨骼肌细胞面积比例

表1示，正常组在第30天和第60天骨骼肌细胞横截面积占视野面积比例(百分比)显著，差异无统计学意义(P<0.05)，模型组第30天和第60天比较差异有统计学意义(P<0.05)，即MTrP造模后肌细胞会持续萎缩。温和灸组第60天骨骼肌细胞横截面积较第30天大且差异显著(P<0.05)，即温和灸后MTrP局部肌细胞面积明显增长，且存在长期效果。同时在第30天时正常组肌细胞百分比最大，模型组最小，温和灸组处于中间，即温和灸可有效预防MTrP 的肌细胞萎缩；第60天时仍是正常组肌细胞百分比最大，模型组最小，温和灸组虽然肌细胞大部分恢复，但尚未达到正常。

表1 不同组别大鼠肌细胞横截面积占视野面积的百分比

2.4 Pax7的免疫荧光检测

图2表2示，正常组在第30天和第60天的Pax7免疫荧光强度比较差异无统计学意义(P<0.05)。模型组在第30天和第60天Pax7比较差异有统计学意义(P<0.05)，即MTrP造模后Pax7持续低表达，第60天时SMSC的Pax7表达微弱。温和灸组第30天和第60天比较差异显著(P<0.05)，即温和灸干预可使MTrP局部SMSC避免过度激活，保持适度的增殖，并补充消耗的SMSC 。

表2 各组Pax7荧光强度数值及比较

3 讨论

肌筋膜疼痛综合征广泛见于全身多处，如咬肌、三角肌、斜方肌、背阔肌、骶棘肌、臀中肌等[12]，至少85%的人都会经历肌筋膜疼痛。各个专科门诊观测到发病率差异较大，普通骨科门诊为21 %，特殊疼痛中心可高达93 %[13]，而老年久坐的女性发病率最高[14]，由此导致的疼痛、功能障碍以及心理负担均极为普遍。但是对肌筋膜疼痛综合征的基础研究却较为缺乏，近年来鲜有进展，故对其病理机制与治疗需要深入研究。

MTrP是肌筋膜疼痛综合征的关键特征，目前的基础研究及临床诊治主要以MTrP为出发点。但MTrP的精确机制仍不明确，尽管现在很多理论揭示外周伤害感受器和中枢敏化等是可能的原因之一[15]。乙酰胆碱增加并在运动终板释放，这个在活动的MTrP上可以用肌电图记录到，但不能作为诊断的标准。增加的乙酰胆碱可导致局部持续的肌节缩短，产生收缩结节。该收缩结节随后引起血管收缩和肌肉的相对缺血。血管活性物质和促炎物质，如前列腺素、缓激肽、血清素和组胺响应这种局部缺血而释放，并使肌肉产生敏感性疼痛。这些物质还可以激活局部自主反应释放更多乙酰胆碱，产生正反馈回路，形成恶性循环。导致MTrP相关异常性疼痛、血流改变、出汗异常、反应性充血以及竖毛反应等[14, 16]。MTrP局部存在炎症因子的高表达[9, 17]，而炎症对骨骼肌干细胞-SMSC存在较复杂的影响，能直接激活并促进SMSC分化[18]。持续的炎症可导致恶性循环，诱发炎症瀑布效应，最终导致SMSC局部的微环境/龛发生变化，SMSC可能无法保持自我复制，可能导致其过度激活并耗竭[19-20]。SMSC耗竭后损伤的肌细胞坏死、萎缩而得不到补偿，同时在炎症因子等作用下，肌束逐渐纤维化，收缩功能减弱或消失，同时导致局部疼痛，由此引发临床症状和功能障碍。

由于肌筋膜疼痛综合征发病机制缺乏研究，其治疗尚未有突破。温和灸作为中医艾灸的代表，在治疗运动系统等疼痛性疾病中广泛应用[21]。但艾灸作用机制复杂，现代研究认为是热、光、烟等刺激，多靶点、多途径激发了机体自身的内源性调节系统，产生了内源性保护物质，进而发挥靶器官调节效应。MTrP局部存在炎症状态[17]，艾灸不仅可降低MTrP局部的炎症因子，亦促进成肌修复[8-9]，也可降低如神经根等炎症[22]。肌筋膜疼痛综合征属于中医伤证范畴，气滞血瘀为主要病机，而温和灸具有良好的行气活血、通络止痛等作用，非常适合肌筋膜疼痛综合征的治疗。本实验造模后HE染色显示，造模理想，在大鼠上成功复制MTrP。实验中为方便而有效的实施温和灸，采用损伤局部即MTrP温和灸治疗。发现温和灸后MTrP炎症细胞浸润明显减轻，这可与以往研究相互印证。且温和灸存在后继疗效，能明显增加肌细胞面积，促进成肌修复。SMSC受到各种原因激活后开始增殖或分化，而增殖后的SMSC重新恢复静止状态，补充SMSC从而保持SMSC的干细胞干性，出现Pax7阳性表达[5]。造模组SMSC的Pax7表达量微弱，表示SMSC大量激活，然而在造模后1个月(第60天)Pax7表达量更微弱，意味着SMSC数量极少且已被过度消耗，趋于耗竭。HE染色发现，造模组在第30天和第60天时MTrP局部的肌细胞数量少且面积占比低，与Pax7的表达一致。研究发现，局部微环境对于SMSC保持干性和数量至关重要[3]，炎症状态下SMSC激活，且多分化成为成纤维细胞等，“炎症瀑布”则导致SMSC无法实现增殖，最终趋于耗竭[23-24]。SMSC趋于耗竭后骨骼肌损伤将难以成肌修复，导致萎缩、纤维化并产生功能障碍等。本研究通过Pax7的检测发现，温和灸后可使MTrP局部的SMSC保持适度的自我复制，抑制其过度的激活，避免SMSC的过度消耗。这种效果在温和灸停止后30 d仍存在，说明温和灸具有良好的调控SMSC增殖、分化的作用。但温和灸的进一步量效关系、具体信号机制等仍需要深入研究。

总之，本研究进行肌筋膜疼痛综合征的大鼠模型造模，成功复制MTrP大鼠模型，并予以温和灸干预MTrP组，发现温和灸可促进MTrP局部的炎症消退，抑制SMSC的过度激活，保护SMSC的适当自我复制，促进骨骼肌修复。