用HPLC法测定家兔血浆中双氯芬酸钠浓度的效果及此药药代动力学的特点

赵宣平，张 瑶，张 磊

（平顶山学院，河南 平顶山 467000）

双氯芬酸钠（DS）是第三代邻氨基苯甲酸类非甾体类抗炎药[1]。此药能抑制环氧化酶的活性，减少前列腺素的生成，进而可起到解热、镇痛、抗炎的作用。过去，临床上主要是采用DS 治疗各种炎性病变或用其对骨科患者进行镇痛治疗[2]。近年来，此药也被临床上用于对接受耳鼻喉手术的患者进行术后镇痛治疗[3]。与其他非甾体类抗炎药相比，DS 的镇痛、抗炎效果更强且副作用更轻微。但此药的半衰期较短，在人体内的代谢速度较快，且其在肝脏中的首过消除现象较为严重[4]。有研究指出，DS 在人体内的生物利用度仅为50% 左右[5]。患者在口服此药后2 h 左右其血药浓度就会逐渐下降，为了保持有效的血药浓度需多次服药。本文主要是探讨采用高效液相色谱（HPLC）法测定家兔血浆中DS 浓度的效果及此药在家兔体内的药代动力学特点。

1 仪器与材料

1100Series 高效液相色谱仪（由美国Agilent 公司生产），TG16X- Ⅱ高速离心机（由长沙东旺仪器有限公司生产），XK96-A 旋涡混合器（由江苏新康医疗器械有限公司生产）。DS 标准品（由南京易亨制药有限公司生产），甲醇和冰醋酸（均由上海方野化工有限公司生产），乙腈，蒸馏水。家兔购于郑州大学实验中心，其许可证编号为SCXK（豫）2019-0001，其体重为1.5 ～2 kg。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 µm），流动相：甲醇:4% 的冰醋酸（浓度比为7:3），检测波长：276 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：25℃。

2.2 空白血浆制备

固定家兔，按需对其进行抽血。将抽取的血液立即注入内部涂有肝素钠的离心管中，以8000 r/min 的转速离心10 min，取上清液（即血浆），并将上清液置于-20℃的冰箱中冻存。

2.3 血样预处理

取500 µl 的家兔血浆样品，在其中加入500 µl 的乙腈。对血浆中的蛋白质及大分子脂类物质进行沉淀，然后对血浆进行2 min 的漩涡处理，使其混匀。以4000 r/min 的转速对血浆进行10 min 的离心处理，取上清液，并用微孔滤膜对上清液进行过滤，备用。

2.4 专属性测定

取空白血浆和DS 标准品，采用HPLC 法并按照2.1 项下的色谱条件分别对空白血浆和DS 标准品进行测定，结果显示，DS 在DS 标准品中的保留时间为6.913 min。详见图1。

图1 DS 的高效液相色谱图

2.5 线性关系考察

分别配制浓度为0.01 µg/mL、3.01 µg/mL、6.01 µg/mL、9.01 µg/mL、12.01 µg/mL 和15.01 µg/mL 的DS 血 浆标准品溶液，并按照2.3 项下的方法进行处理，记录数据并绘制标准曲线。得到线性方程：Y=11.876X+7.5931，R2=0.997，且DS 的浓度在0.01 ～15.01µg/mL 的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

取0.5 mL 浓度为15 µg/mL 的DS 溶液，在溶液中加入0.5 mL 的空白兔血浆，得到浓度为7.5 µg/mL 的DS 血浆溶液。对DS 血浆溶液进行过滤，采用HPLC 法并按照2.1项下的色谱条件分别于一天内的不同时间点对DS 血浆溶液进行测定，分别记录其峰面积和相对标准偏差（RSD）。结果显示，DS 血浆溶液在时间1、时间2、时间3、时间4 和时间5 的峰面积分别为102.33、106.35、108.06、102.15和106.51，其峰面积的RSD 为2.5。详见表1。这一结果表明该检测方法的精密度良好。

表1 进行精密度试验的结果

2.7 回收率试验

分别配置浓度为6.02 µg/mL、18.02 µg/mL和30.02 µg/mL的DS 血浆溶液（DS 和血浆之比为1:1），并按照2.3 项下的方法进行处理。采用HPLC 法并按照2.1 项下的色谱条件分别对各浓度的DS 血浆溶液进行5 次测定，依据标准曲线计算各自的浓度及回收率。结果显示，当DS 血浆溶液中加入DS 的浓度为3.01 µg/mL、9.01 µg/mL 和15.01 µg/mL 时，DS 的回收率分别为99%、105%和96%。详见表2。

表2 进行回收率试验的结果

2.8 稳定性试验

配置浓度为3.01 µg/mL、9.01 µg/mL 和15.01 µg/mL的DS 血浆溶液，将其分别在室温下放置0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h，然后采用HPLC 法并按照2.1 项下的色谱条件分别对DS 血浆溶液进行测定，记录其峰面积和RSD。结果显示，不同浓度的DS 血浆溶液在不同时间点的RSD 均小于5%，这表明DS 血浆溶液在48 h 内的稳定性良好。

2.9 家兔血浆中DS 的浓度及DS 在家兔体内的主要药代动力学参数

取6 只家兔（雄雌兼有），为其称重，按照10 mg/kg 的剂量向其大腿肌肉内注射DS。分别于注药后的5 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、180 min 和240 min 采集其心脏血1 mL。将血液标本置于涂有肝素钠的离心管中，混匀后进行离心处理，取血浆。之后按照2.3 项下的方法对血浆进行处理，用HPLC 法并按照2.1 项下的色谱条件分别对血浆中DS 的浓度进行测定，记录各项数据，绘制药- 时曲线，并采用DAS2.0 软件计算DS 在家兔体内的药代动力学参数。结果显示，DS 在家兔体内的药代动力学特点为二室模型（指药物首先进入心、肝、肾等中央室并在该室均匀分布，之后再缓慢地分布到肌肉、皮肤、脂肪等周边室）。详细研究结果见表3、图2 及表4。

表3 DS 的药时数据表

图2 DS 在家兔血浆中的浓度-时间曲线图

表4 DS 在家兔体内的主要药代动力学参数

3 讨论

本研究为了避免DS 对家兔的胃部产生刺激，故为其肌内注射此药进行实验[6]。为了保证采血时间的准确性，在实验过程中应对家兔进行心脏取血[7]。需要注意的是，在取血时应找准家兔的心室，防止扎入其心脏起搏点而导致其中途死亡。本研究的结果显示，采用HPLC 法测定家兔血浆中DS 浓度的准确性和稳定性良好，且不受家兔体内内源性物质及代谢物的干扰。本研究在采用HPLC 法测定家兔血浆中DS 的浓度时所用的流动相为甲醇:4% 的冰醋酸。4% 的冰醋酸易挥发，因此每次实验前都要更换最新配置的流动相，以保证实验数据的准确性和稳定性。

本研究的结果证实，采用HPLC 法测定家兔血浆中DS的浓度具有操作简便、准确性高、重复性和稳定性好等优点。DS 在家兔体内的药代动力学特点为二室模型。