缺氧对自然调节性T 细胞的影响

许桐彤 徐振健 陈丽玲 陈秋菊 徐安平

调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）是一类具有负向免疫调节功能的T 细胞亚群，因Tregs能调节机体免疫反应而被应用在众多疾病的研究中，如自身免疫性疾病、炎症性疾病和肿瘤等。根据来源，Tregs 可分为自然调节性T 细胞（natural regulatory T cells，nTregs）和诱导调节性T 细胞（in⁃duced regulatory T cells，iTregs）。nTregs 主要来源于胸腺，iTregs 是由外周幼稚T 细胞在抗原的刺激下转化而来，二者均通过关键转录因子FoxP3 来调节机体免疫反应。在正常的情况下，nTregs 与辅助性T 细胞（helper T cells，Th）协同维持机体正常的免疫反应。然而，在免疫炎症反应情况下，这种平衡可能会被打破，出现Th 数量增多和功能增强，进而可导致nTregs 的功能不稳定［1，2］。另外，多项研究表明在免疫炎症状态下，nTregs 可能表达与辅助性T 细胞（Th17）分化相关的转录因子RORγt（retinoic acid⁃related orphan receptor⁃γt）［3，4］，即RORγt+nTregs。RORγt+ nTregs 被认为是处于向促炎型Th17 分化的过渡阶段。这提示我们nTregs 在免疫炎症状态下的功能可能不稳定，甚至可能具有促炎作用。

许多疾病都存在缺氧的病理生理过程。病理性缺氧是引起免疫炎症反应的常见原因［5］。说明缺氧与免疫反应密切相关。在本研究中，我们通过体外缺氧来模拟组织缺氧环境，进而研究缺氧对nTregs 中转录因子的表达情况以及对nTregs 功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 实验所用C57BL/6 小鼠购于广东省实验动物中心；分选nTregs 所用试剂购于德国MiltenyiBiotec；流 式 抗 体FITC anti⁃mouse CD3e、perCP⁃cy5.5 anti⁃mouse CD4、PE anti⁃mouse CD25、BV421 anti⁃mouse FoxP3 以及流式细胞仪均购买自美 国BD 公 司；westernblot 所 用STAT3 抗 体、p⁃STAT3 抗体、RORγt 抗体购自英国Abcam 公司，GAPDH 抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；CFSE 试剂购于美国Biolengend 公司；缺氧模型所需培养箱购自德国Eppendorf 公司；常氧培养箱购于美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 实验方法 （1）分选nTregs：取C57BL/6 小鼠的脾脏于细胞筛网中研磨后移至离心管，离心，弃上清，裂红。根据MiltenyiBiotec 的试剂（130⁃091⁃041）说明孵育CD4+CD25+ Regulatory T cell Biotin⁃Antibody Cocktail、Anti⁃BiotinMicroBeads 和CD25⁃PE antibody 后过LS 分选柱得到细胞悬液；在上述悬液中加适量Anti⁃PE MicroBeads 孵育，按说明过MS 分选柱即得到nTregs；（2）建立体外缺氧条件：将得到的nTregs 种于96 孔板中，加入IL⁃2、TGF⁃β和anti⁃mouseCD3 抗体和anti⁃mouse CD28 抗体混匀后置于1%氧浓度的培养箱中进行缺氧处理，同时设立常氧环境细胞培养组作为对照（5%二氧化碳，95%空气）；（3）流式细胞术检测细胞：收集细胞于流式管中，加1 mL PBS 离心洗1 次，去掉上清，200 μL PBS 重悬，加细胞表面抗体4℃避光孵育15 分钟，2 mL PBS 离心洗一次，使用transcrip⁃tion factor buffer set 固定后加胞内转录因子抗体4℃避光孵育30 分钟后破膜，加200 μL PBS 重悬上机检测；（4）蛋白质免疫印迹（western blot）：提取细胞总蛋白后，将20 μg 的蛋白样品加到SDS⁃PAGE 胶中进行电泳，完成后电转到PVDF 膜上。用5% BSA 室温封闭1 h，随后加入相关一抗在4℃孵育过夜。一抗浓度依据抗体说明书使用；GAPDH 的一抗浓度为1∶5000。室温孵育二抗1 h后，用G：BOX 智能显像系统（英国Syngene 公司）采集条带图片，应用ImageJ 对条带进行半定量分析；（5）Th 细胞增殖：小鼠脾脏研磨后置于尼龙毛柱中37℃孵育30 分钟后除去柱中液体，将尼龙毛浸于PBS 中反复吹打，将悬液移至离心管后离心，弃上清，加丝裂霉素溶液孵育后得到APC 细胞，与上述柱中液体中得到的Th⁃CFSE 共培养3 天后流式细胞仪测Th 增殖。

1.3 统计方法 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8 对实验数据进行处理。采用流式分析软件Flow⁃Jo VX 对流式数据进行分析。所有结果以（±s）表示，采用Student's t⁃test 进行两组间数据的比较，采用multiplet⁃test 进行多组间数据的比较，以P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 缺氧影响FoxP3 在nTregs 中的表达 当体外缺氧处理15 分钟后，nTregs 中的关键转录因子FoxP3 在胞内的表达开始下降。我们通过流式细胞术选定CD3+CD4+的T 细胞亚群（图1A），分析该细胞亚群中CD25 和FoxP3 的表达情况。图1B和图1C 中，基线组（baseline）为新鲜提取的nTregs，0 分钟（0 min）指在常氧条件下培养1 天。与基线组和常氧组（0 min）相比，体外缺氧15 分钟后，FoxP3 在nTregs 中的比例出现明显下降（P＜0.05）；同时我们发现，在体外缺氧6 小时和12 小时后，FoxP3 的表达仍然呈现下降趋势（P＜0.01）。以上结果提示体外缺氧能够持续抑制nTregs 中FoxP3 的 表 达。

2.2 缺 氧 诱 导nTregs 向RORγt+nTregs 转 化因nTregs 中FoxP3 的表达在体外缺氧15 分钟出现明显下降，我们应用蛋白质免疫印迹法（west⁃ern blot）检测了体外缺氧15 分钟后nTregs 中的转录因子RORγt，STAT3 以及磷酸化的STAT3（p⁃STAT3）的表达情况。图2 中，当nTregs 体外缺氧15 分钟后，与常氧组相比，缺氧后转录因子RORγt 的表达增多（P＜0.05），同时p⁃STAT3 比例增多（P＜0.01），但STAT3 表达无变化，与上述FoxP3 的变化相对应。说明体外缺氧可以诱导nTregs 转化为RORγt+ nTregs，且p⁃STAT3 可能参与其中。

图1 缺氧影响Foxp3 在nTregs 中的表达

图2 缺氧后nTregs 可能向Th17 细胞转化

2.3 缺氧影响nTregs 对Th 细胞的抑制作用 我们通过流式分析发现，在常氧的情况下，Th 细胞在体外增殖能力活跃，nTregs 通过抑制Th 细胞的增殖发挥免疫调节功能（图3A，P＜0.0001）。当对nTregs 进行15 分钟的体外缺氧处理后，与未缺氧nTregs 相比（baseline），nTregs 对Th 细胞的抑制作用明显减弱（图3B，P＜0.0001）。说明体外缺氧能够影响nTregs 的免疫抑制功能。

图3 缺氧影响nTregs 对Th 细胞的抑制作用

3 讨 论

在免疫炎症状态下，nTregs 通过FoxP3 的调控能直接或间接抑制靶细胞［6］。然而，nTregs 对一些免疫炎症性疾病的抑制作用并不理想［7］。研究表明在炎症性肠病小鼠的肠道中发现具有促炎作用的RORγt+nTregs［3］，提示nTregs 在免疫炎症状态下不稳定。

病理性缺氧本质上是诱发免疫炎症反应的病理生理过程。组织缺氧时，T 细胞、B 细胞和巨噬细胞募集到受损的部位，通过释放IL⁃1、IL⁃6 和TNF 等细胞因子促进炎症级联反应。此外，被激活的缺氧诱导因子HIF 通过促进FoxP3 的降解、STAT3 和RORγT 的激活来调节Th17 和Tregs 之间的平衡［8］。

本研究发现nTregs 在缺氧的环境中不能维持原有的免疫抑制功能，其机制可能与缺氧导致nTregs 中的转录因子FoxP3 失活和STAT3 激活有关。我们还发现体外缺氧诱导nTregs 表达RORγt使nTregs 向Th17 方向转化，为缺氧导致的免疫炎症性疾病提供实验依据。