利福平通过抑制蛋白激酶R 活化调节鱼藤酮诱导的小胶质细胞炎症而发挥神经保护作用

邓嘉强 井秀娜 林淡钰 卜璐璐 陈颖 陶恩祥

帕金森病（PD）是常见神经退行性疾病，主要以黑质多巴胺能神经元的变性和路易小体的形成为病理特征。目前PD 确切的病因和发病机制尚不完全清楚，最近研究表明持续存在的免疫反应参与了帕金森病的发病机制［1］。神经炎症在死后PD 患者大脑中仍存有明显的病变特征，NLRP3炎症小体是PD 病理过程中发挥主要调控作用的炎症小体，异常聚集的α⁃syn 能激活NLRP3炎症小体诱发神经炎症，导致多巴胺能神经元变性、丢失［2］。因此，抑制NLRP3炎症小体的激活，可作为治疗PD 的重要方案。

有研究发现，在抑制PKR 活化后可以抑制NLRP3炎症小体的激活和IL⁃1β 的成熟和分泌［3］。利福平可通过抑制NLRP3炎症小体的激活来减轻小胶质细胞炎症毒性［4］，并且利福平可以抑制PERK⁃eIF2α⁃ATF4 通路缓解内质网应激保护多巴胺能神经元［5］。PKR 与PERK 都是eIF2α 系列分子，siRNA 靶向PERK 能抑制PKR 活化［6］。因此，我们猜测利福平能通过抑制PKR 活化减轻神经炎症发挥神经保护作用。为进一步验证利福平抑制PKR 活化缓解神经炎症，我们观察了利福平对鱼藤酮诱导下BV2细胞内p⁃PKR、Caspase⁃1、NLRP3、IL⁃1β 等蛋白的表达水平的影响，进一步探索了利福平抑制神经炎症发挥神经保护作用的相关机制，旨在为帕金森病的治疗和预防提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 试剂和材料 DMEM 培养基、D/F12 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco 公司；Rotenone 购自美国APExBio 公司；Rifampicin 购自美国Sigma 公司；C16（PKR 抑制剂）购自美国Merck⁃Millipore 公司；兔抗PKR 抗体购自美国艾菲公司；兔抗phos⁃phoT446⁃PKR 抗体购自美国SAB 公司，兔抗IL⁃1β抗体、兔抗NLRP3抗体、兔抗Caspase⁃1 抗体购自美国Abcam 公司；β⁃actin 抗体购自美国Abcam，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自美国CST 公司；细胞凋亡试剂盒购自美国BD 公司；6 孔Transwell细胞共培养小室购自Corning 公司。

1.2 主要方法 （1）细胞培养用D/F12 培养基重悬细胞，1000 r/min 离心5min 弃去上清，细胞接种在含有10%胎牛血清（FBS）的D/F12 培养基中，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，每天用PBS洗1 遍再更换培养基，当细胞融合度达到80%时，用胰蛋白酶消化下来后，按1∶5 进行传代。（2）实验分组实验分为5 组，（1）空白对照组（2）鱼藤酮组（3）利福平组（4）利福平预处理组（5）C16 预处理组。

1.3 Western blot 法检测利福平预处理对鱼藤酮诱导的p⁃PKR、PKR、NLRP3、Caspase⁃1、IL⁃1β 表达的影响 各组细胞按2.2 分组，经药物孵育后，用细胞裂解液在冰上裂解，12000 r/min 离心30 min 后收集上清。用BCA 蛋白分析试剂盒测定各组蛋白浓度。以每组蛋白上样量为20 μg 进行SDS⁃PAGE 凝胶电泳。取适量的蛋白进行蛋白变性、凝胶电泳、转膜、封闭。一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，二抗室温孵育2 h，TBST 洗膜3 次。用ECL 发光液在成像仪中成像显影，用ImageJ 软件对获得的蛋白条带图像进行分析。

1.4 细胞共培养 将重悬的BV2 细胞按3×105个/孔的密度接种在共培养皿的下室，用含有10%血清的D/F12 培养基培养，同时SH⁃SY5Y 细胞以3×105个/孔的密度接种在共培养皿的上室，待细胞贴壁后按上述实验分组情况进行药物孵育处理。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 胰酶消化收集共培养皿上室中SH⁃SY5Y 细胞，离心弃掉上清后，再用2 mL PBS 清洗细胞，1000 r/min，离心5 分钟，设置1 个空白对照和5 个实验组，每个实验组加入5 μL V450⁃A 试剂混匀，于室温避光反应10-15 min 后，再加入10 μL PI 试剂混匀，半小时内完成上机检测。

1.5 统计学分析 我们进行了3 个独立的实验，所有的实验条件被重复或三次测试，应用Graph⁃pad Prism 软件分析实验数据和作图，定量数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One⁃way ANOVA）统计方法，当P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 利福平可以抑制PKR 磷酸化 见图1。

图1 利福平可以抑制鱼藤酮诱导的小胶质细胞中PKR 活化

2.2 利福平可通过抑制PKR 活化调节鱼藤酮诱导的小胶质细胞炎症 见图2。

2.3 利福平可通过抑制PKR 活化减轻神经炎症介导的细胞凋亡 见图3。

图2 利福平通过抑制PKR 活化对NLRP3、IL⁃1β、Caspase⁃1 等蛋白表达的影响

3 讨 论

各种致病因素刺激小胶质细胞活化释放各种促炎症因子加剧神经元变性、丢失，在A53T 基因突变的PD 小鼠模型中发现黑质部位大量活化的小胶质细胞，且出现PD 相关的异常行为学特征［7］。相比健康人群，PD 患者的脑脊液和血液等生物液检测发现IL⁃1β、NLRP3炎症小体表达水平明显升高［8］。因此，阻断神经炎症可以延缓脑黑质多巴胺神经元变性、坏死，对PD 患者的治疗和预防起着重要的作用。

炎症小体的激活可以引导先天免疫系统对致病刺激的反应和致病物质的产生，NLRP3炎症小体是近几年来研究最广泛的一种，小胶质细胞内NLRP3炎症小体的激活释放各种细胞因子，这些炎性物质又进一步激活NLRP3炎症小体，导致恶性循环形成［9］。因此，抑制NLRP3激活来缓解神经炎症诱导的神经元损伤，为神经退行性疾病治疗提供新的指导。

图3 利福平通过抑制PKR 活化减轻小胶质细胞炎症诱导的SH⁃SY5Y 细胞凋亡

在PD 患者脑组织切片中发现退化神经元中磷酸化PKR 表达水平上调，促使多巴胺神经元变性和丢失，PKR 可以调节NLRP3炎症小体的激活、Caspase⁃1 的活化和IL⁃1β 的成熟，恶化神经炎症反应，而抑制PKR 活化能有效减轻相应的炎症反应［11］。由此可知，PKR 活化对NLRP3炎症小体激活在神经退行性疾病中起重要作用。实验发现，与空白组相比，鱼藤酮组发现p⁃PKR、NLRP3、IL⁃1β、Caspase⁃1 等蛋白的表达水平均明显上调，而利福平组无改变。利福平预处理组或C16 预处理组，以上蛋白的表达水平得到逆转。

PKR 活化调节NLRP3炎症小体依赖性细胞因子的释放。由此可见，抑制PKR 活化可减轻NLRP3诱发的神经炎症，为慢性神经退行性疾病的治疗和进展提供了新的方向。在本实验中，我们发现，用接受不同处理的BV2 小胶质细胞与SH⁃SY5Y 细胞共培养24 小时后，用流式细胞术检测细胞凋亡率。与空白组相比，鱼藤酮组细胞凋亡水平明显升高，利福平组细胞凋亡水平没有变化。与鱼藤酮组相比，利福平预处理组或C16 预处理组，细胞凋亡水平出现反转。

综上所述，PKR 诱导的神经炎症在神经退行性病变过程中起着重要作用。利福平减轻小胶质细胞炎症介导的细胞损伤，这可能与利福平调控PKR 活化有关。本实验研究扩展了利福平对神经元的保护作用，若能进一步明确利福平抑制过表达PKR 诱导NLRP3炎症小体的激活的调控机制，将为新型抗PD 药物研发提供新的指导。