土贝母苷甲通过调控circ_0000376/miR-203轴影响皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞恶性表型

王娟, 肖春才, 屈小燕, 张晨阳

郑州大学附属郑州中心医院皮肤科,河南 郑州 450007

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)是常见的非黑色素性皮肤癌，多见于手背、头发和面部等光暴露部位，可发生恶性转移，危及患者生命[1]。目前，CSCC的治疗以根治性手术切除为主，多数患者预后良好，但晚期及复发和转移患者的预后仍不佳[2]。因此，寻找有效治疗CSCC的方法仍然十分必要。土贝母苷甲是中药土贝母的主要活性成分之一，具有抗炎、抗病毒和免疫抑制等功效。近年来研究显示，土贝母苷甲还发挥抗肿瘤作用，其可通过调控PI3k-Akt-mTOR信号通路抑制乳腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡和自噬[3]，通过抑制MMP-2和MMP-9活性降低肝癌细胞的迁移和侵袭性[4]，具有研发为肿瘤治疗药物的潜在价值。但目前土贝母苷甲对CSCC细胞恶性表型的影响及作用机制还未知。

环状RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)是两类小分子非编码RNA，circRNA可作为竞争性内源性RNA与miRNA靶向结合，调控miRNA靶基因的表达，进而发挥生物学调控作用，在肿瘤的发生发展中起重要作用[5-6]。研究显示，circ_0000376在非小细胞肺癌[7]、乳腺癌[8]和胃癌[9]等肿瘤中表达升高，促进肿瘤的发展进程。但目前，circ_0000376对CSCC发生发展的影响也还未知。StarBase生物信息学软件预测显示，circ_0000376可能靶向结合miR-203。有报道称，miR-203在CSCC组织中表达下调，上调其表达可靶向抑制PRC1的表达并阻断Wnt /β-catenin信号通路，降低CSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并加速细胞凋亡，可作为CSCC治疗的分子靶点[10]。因此，本研究以CSCC细胞系SCL-1为研究对象，circ_0000376/miR-203轴为切入点，探究了土贝母苷甲对SCL-1细胞恶性表型(增殖、迁移、侵袭和凋亡)的影响及可能机制，以期为CSCC的治疗提供新途径。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

皮肤鳞状细胞癌细胞株SCL-1(中国科学院上海细胞库)；土贝母苷甲(纯度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司)；RPMI 1640培养基、LipofectamineTM2000试剂盒、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒(北京索莱宝公司)；逆转录试剂盒、PCR试剂盒(大连宝生物公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；PCR引物、circ_0000376小干扰RNA(si-circ_0000376)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、circ_0000376过表达载体(pcDNA-circ_0000376)、空载体(pcDNA)、miR-203 模拟物(mimcs)、模拟对照序列(miR-NC)、circ_0000376野生型质粒(WT-circ_0000376)和突变型质粒(MUT-circ_0000376)(上海吉玛制药技术有限公司)；兔抗人Ki-67、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)抗体(美国Santa Cruz公司)；双荧光素酶活性检测试剂盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 复苏SCL-1细胞，用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。当细胞生长密度至80%左右时，0.25%胰蛋白酶消化，以1 ∶3比例进行传代培养。将SCL-1细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板中，用LipofectamineTM2000脂质体法分别转染si-NC、si-circ_0000376、pcDNA、pcDNA-circ_0000376。转染6 h后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞，RT-qPCR法检测细胞中circ_0000376表达验证转染效果，同时检测细胞中miR-203的表达，观察circ_0000376对miR-203表达的影响。

1.2.2 细胞分组及处理 未转染的SCL-1细胞分为对照组、土贝母苷甲低剂量组、土贝母苷甲中剂量组、土贝母苷甲高剂量组，对照组细胞用常规培养基培养，土贝母苷甲低剂量、中剂量、高剂量组细胞分别用含5、10、20 μg/mL[3]土贝母苷甲的培养基培养。转染si-NC、si-circ_0000376的细胞用常规培养基培养，记为si-NC组、si-circ_0000376组。转染pcDNA、pcDNA-circ_0000376的细胞用含20 μg/mL 土贝母苷甲的培养基培养，记为土贝母苷甲+pcDNA组、土贝母苷甲+pcDNA-circ_0000376组。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖 将分组处理后的细胞均接种于96孔板中(2.5×104个/孔)，培养24 h后，加10 μL CCK-8，孵育2 h，用酶标仪450 nm测吸光度(A)值。抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.2.4 Transwell检测细胞迁移和侵袭 将分组处理后的细胞均接种于24孔板中(5.0×104个/孔)，培养24 h后，收集细胞，并调整密度为5×104个/mL。迁移实验：Transwell小室置于24孔板中，上室加100 μL细胞悬液，下室加500 μL培养基。培养24 h后，弃培养基，取出小室。用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，显微镜观察。随机取5个视野计数。侵袭实验：预先在Transwell上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后，再加100 μL细胞悬液，后续操作同迁移实验。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将分组处理后的细胞均接种于6孔板中(2.5×105个/孔)，培养24 h后，收集细胞，PBS清洗2次。取1.0×106个细胞，加500 μL结合缓冲液，混悬细胞。依次加10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 Western blot法检测Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表达 将分组处理后的细胞均接种于6孔板中(2.5×105个/孔)，培养24 h后，RIPA试剂提取细胞总蛋白，并用BCA法检测蛋白含量。然后行SDS-PAGE电泳。电泳后，将分离蛋白转至PVDF膜，于5 %脱脂奶粉溶液中封闭1 h。分别于Ki-67(1 ∶500)、MMP-2(1 ∶500)、MMP-9(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶ 1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)一抗孵育液中，4 ℃过夜。再于山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)孵育液中，37 ℃孵育1 h。加显影液避光显影，曝光拍照。

1.2.7 RT-qPCR检测circ_0000376和miR-203表达 将分组处理后的细胞均接种于6孔板中(2.5×105个/孔)，培养24 h后，用Trizol试剂提取细胞中RNA，并逆转录为cDNA，行PCR扩增。扩增程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环。引物序列：circ_0000376上游5′-AGGTTCTCCAGCATTTGGCT-3′，下游5′-TGAATGAAAAAGTTAGTCAGGCAT-3′；miR-203上游5′-GTCGCAGATCGACGACGACG-3′，下游5′-CGACG-ATACGAGCGGGCC-3′；GAPDH上游5′-GGTCTC-CTCTGACTTCAACA-3′，下游5′-GTGAGGGTCTCT-CTCTTCCT-3′；U6上游5′-GTAGATACTGCAGTA-CG-3′，下游5′-ATCGCATGACGTACCTGAGC-3′。2-△△Ct法计算circ_0000376相对于GAPDH、miR-203相对于U6的表达水平。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 将SCL-1细胞以2.5×105个/孔接种于6孔板中，LipofectamineTM2000脂质体法分别共转染miR-NC或WT-circ_0000376与miR-203 mimics或miR-NC、MUT-circ_0000376与miR-203 mimics。转染6 h后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞，检测细胞荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS.22.0软件分析实验数据。对照组、土贝母苷甲低剂量组、土贝母苷甲中剂量组和土贝母苷甲高剂量组四组间各检测指标比较首先用单因素方差分析，进而组间两两比较用LSD-t检验；si-NC组与si-circ_0000376、土贝母苷甲+pcDNA组与土贝母苷甲+pcDNA-circ_0000376组各检测指标比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 土贝母苷甲对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖的影响

用含不同剂量(5、10、20 μg/mL)土贝母苷甲的培养基培养SCL-1细胞24 h后，与对照组比较，SCL-1细胞增殖抑制率提高(P<0.05)，增殖相关蛋白Ki-67表达抑制(P<0.05)，且与土贝母苷甲呈剂量依赖性，说明土贝母苷甲可抑制SCL-1细胞增殖，详见表1。

表1 土贝母苷甲对SCL-1细胞增殖的影响Tab.1 The effects of tubeimoside-1 on the

2.2 土贝母苷甲对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞迁移和侵袭的影响

如图1和表2所示，用含不同剂量(5、10、20 μg/mL)土贝母苷甲的培养基培养SCL-1细胞24 h后，SCL-1细胞迁移和侵袭数降低(P<0.05)，迁移和侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达降低(P<0.05)，且与土贝母苷甲呈剂量依赖性，说明土贝母苷甲可抑制SCL-1细胞迁移和侵袭。

图1 Transwell检测土贝母苷甲对SCL-1细胞迁移和侵袭的影响Fig.1 The effects of tubeimoside-1 on the migration and invasion of SCL-1 cells were detected by Transwell.

表2 土贝母苷甲对SCL-1细胞迁移和侵袭的影响Tab.2 The effects of tubeimoside-1 on the migration and invasion of SCL-1

2.3 土贝母苷甲对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞凋亡的影响

用含不同剂量(5、10、20 μg/mL)土贝母苷甲的培养基培养SCL-1细胞24 h后，与对照组比较，SCL-1细胞凋亡率提高(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低(P<0.05)，而促凋亡蛋白Bax的表达增加(P<0.05)，且与土贝母苷甲呈剂量依赖性，说明土贝母苷甲可促进SCL-1细胞凋亡，详见表3。

表3 土贝母苷甲对SCL-1细胞凋亡的影响Tab.3 The effects of tubeimoside-1 on the apoptosis of SCL-1

2.4 土贝母苷甲对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞circ_0000376和miR-203表达的影响

如表4所示，用含不同剂量(5、10、20 μg/mL)土贝母苷甲的培养基培养SCL-1细胞24 h后，与对照组比较，SCL-1细胞中circ_0000376的表达降低(P<0.05)，而miR-203表达增加(P<0.05)，且与土贝母苷甲呈剂量依赖性，说明土贝母苷甲可抑制SCL-1细胞中circ_0000376表达，而促进miR-203表达。

表4 土贝母苷甲对SCL-1细胞中circ_0000376和miR-203表达的影响Tab.4 The effects of tubeimoside-1 on the expression of circ_0000376 and miR-203 in SCL-1

2.5 circ_0000376靶向调控miR-203的表达

StarBase生物信息学软件预测显示，circ_0000376与miR-203的核苷酸序列存在连续结合位点，见图2。与共转染WT-circ_0000376+miR-NC的细胞比较，共转染WT-circ_0000376+miR-203 mimics的细胞荧光素酶活性降低(0.56±0.04比1.06±0.08，t=16.77，P<0.05)；而与共转染MUT-circ_0000376+miR-NC的细胞比较，共转染MUT-circ_0000376+miR-203 mimics的细胞荧光素酶活性无明显变化(1.01±0.06比1.03±0.07，t=0.65，P=0.524)，说明circ_0000376可与miR-203靶向结合。pcDNA-circ_0000376组SCL-1细胞中miR-203表达水平低于pcDNA组(0.39±0.03比1.00±0.04，t=36.60，P<0.05)，而si-circ_0000376组SCL-1细胞中miR-203表达水平高于si-NC组(3.15±0.21比1.02±0.09，t=27.97，P<0.05)，说明circ_0000376负调控miR-203。

图2 circ_0000376与miR-203互补的核苷酸序列Fig.2 The complementary nucleotide sequences of circ_0000376 and miR-203.

2.6 敲减circ_0000376对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

如图3、表5和表6所示，转染si-circ_0000376的SCL-1细胞中circ_0000376表达明显低于转染si-NC的细胞(P<0.01)，说明敲减circ_0000376的SCL-1细胞构建成功；敲减circ_0000376后，SCL-1细胞增殖抑制率和凋亡率升高(P值均<0.01)，迁移和侵袭数降低(P值均<0.01)，相关蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的表达降低(P值均<0.01)，而Bax表达升高(P<0.01)，说明敲减circ_0000376抑制SCL-1细胞增殖、迁移和侵袭，且促进其凋亡。

图3 Transwell检测敲减circ_0000376后SCL-1细胞迁移、侵袭Fig.3 The migration and invasion of SCL-1 cells after knocking down circ_0000376 were detected by Transwell.

表5 敲减circ_0000376对SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Tab.5 The effects of knocking down circ_0000376 on the proliferation, migration, invasion and apoptosis of SCL-1

表6 敲减circ_0000376对SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达的影响Tab.6 The effects of knocking down circ_0000376 on the proliferation, migration, invasion and expression of apoptosis-related proteins in SCL-1

2.7 过表达circ_0000376逆转土贝母苷甲对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用

如图4、表7和表8所示，与土贝母苷甲+pcDNA组比较，土贝母苷甲+pcDNA-circ_0000376组SCL-1细胞中circ_0000376表达升高(P<0.01)，细胞增殖抑制率和凋亡率降低(P值均<0.01)，迁移和侵袭数升高(P值均<0.01)，相关蛋白Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2表达升高(P值均<0.01)，而Bax表达降低(P<0.01)，说明过表达circ_0000376逆转了土贝母苷甲对SCL-1细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及对凋亡的促进作用。

图4 Transwell检测土贝母苷甲对过表达circ_0000376的SCL-1细胞迁移、侵袭的影响Fig.4 The effects of tubeimoside-1 on the migration and invasion of SCL-1 cells overexpressing circ_0000376 were detected by Transwell.

表7 过表达circ_0000376逆转土贝母苷甲对SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用Tab.7 Overexpressing circ_0000376 reversed the effects of tubeimoside-1 on the proliferation, migration, invasion and apoptosis of SCL-1

表8 过表达circ_0000376逆转土贝母苷甲对SCL-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达的作用Tab.8 Overexpressing circ_0000376 reversed the effects of tubeimoside-1 on proliferation, migration, invasion and apoptosis-related proteins expression in SCL-1

3 讨论

土贝母是我国传统中药，其活性成分包括土贝母苷甲、土贝母苷乙和土贝母苷丙。研究显示，土贝母苷甲可通过下调VEGF/VEGFR2和Ang2/Tie2信号传导途径抑制非小细胞肺癌异种移植瘤血管生成[11]。本研究将5、10、20 μg/mL土贝母苷甲作用于CSCC细胞24 h，结果发现，CSCC细胞的增殖能力、迁移和侵袭数均明显降低，且凋亡加剧，提示土贝母苷甲可抑制CSCC细胞的恶性行为，具有抗CSCC的作用。

肿瘤细胞的恶性表型受多种分子调控。Ki-67是细胞增殖核抗原，肿瘤细胞增殖的标志性蛋白[12]。MMP-2和MMP-9属于基质金属蛋白酶家族成员，其可降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[13]。Bax和Bcl-2参与调控细胞凋亡，其中Bax为促凋亡分子，表达增加时形成同源二聚体，改变细胞线粒体膜通透性，引起细胞色素C释放量增加，进而激活caspase信号途径，诱导细胞凋亡；而Bcl-2是抗凋亡分子，其表达增加时与Bax形成异源二聚体，减弱Bax的促凋亡作用[14]。本研究显示，土贝母苷甲可呈剂量依赖性抑制CSCC细胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表达，而促进Bax蛋白表达，提示土贝母苷甲可能通过直接或间接调控与细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡相关的蛋白活性来影响CSCC细胞的恶性表型。

circRNA是一类呈闭合环状的非编码RNA，在肿瘤发生发展中发挥重要调控作用。目前，研究已表明，circ_0070934[15]、circ_0070934[16]等多种circRNA在CSCC组织或细胞系中异常表达，参与调控CSCC细胞的增殖和侵袭等恶性行为，为CSCC的发病机理提供了新的见解。本研究显示，敲减circ_0000376可有效减弱CSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且促进细胞凋亡，提示circ_0000376促进CSCC的发展进程，其也可作为CSCC治疗的分子靶点。本研究还显示，土贝母苷甲可剂量依赖性降低CSCC细胞中circ_0000376的表达，而过表达circ_0000376逆转土贝母苷甲对CSCC细胞恶性表型的抑制作用，提示土贝母苷甲可能通过下调circ_0000376来抑制CSCC细胞的恶性表型。

为了进一步探究土贝母苷甲可能通过下调circ_0000376抑制CSCC细胞恶性表型的分子机制，本研究利用双荧光素酶报告基因实验证实了circ_0000376可靶向结合miR-203，且敲减circ_0000376促进了CSCC细胞中miR-203的表达，说明circ_0000376靶向负调控miR-203。以往研究显示，miR-203在前列腺癌[17]、食管癌[18]、三阴性乳腺癌[19]和甲状腺癌[20]等肿瘤中表达升高，上调其表达可抑制肿瘤细胞的恶性表型，在肿瘤中发挥抑癌基因作用。本研究显示，土贝母苷甲可促进CSCC细胞中miR-203的表达，且过表达circ_0000376逆转土贝母苷甲对CSCC细胞中miR-203表达的促进作用，进一步提示土贝母苷甲通过靶向下调circ_0000376进而促进miR-203的表达来抑制CSCC细胞的恶性表型。

综上所述，土贝母苷甲可剂量依赖性减弱CSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且加速细胞凋亡，发挥一定的抑制CSCC的作用，其作用机制可能与调控circ_0000376/miR-203轴有关。