泛素特异性蛋白酶10在低氧性肺动脉高压中的表达及对USP10-AMPK信号通路的调控作用*

岳珍珍, 郭森, 焦义明

1郑州大学第一附属医院郑东院区心脏重症监护病房(河南郑州 450052)； 2郑州大学第一附属医院心血管内科(河南郑州 450000)； 3郑州大学第二附属医院体检科(河南郑州 450014)

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PAH)是以肺动脉压力增高、伴或不伴有肺小动脉病变的一种血流动力学和病理生理状态，可引起肺循环淤阻及右心衰竭，是各种肺源性心脏病和高山性心脏病的重要发病环节和致死原因，具有较高的致残、致死率[1-2]。了解PAH的发生机制，对于制定有效的防治措施，降低PAH病残、病死率有重要意义。泛素特异性蛋白酶10(ubiquitin-specific protease 10，USP10)能调节细胞的生长周期，通过多种途径调控细胞的生理病理变化[3]。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是机体重要的能量代谢受体。研究显示[4-5]，USP10可特异性地去除AMPKα的泛素化，引起AMPK的不当激活和多种代谢缺陷，AMPK/磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(prtein kinase B，Akt)途径是包括PAH在内的多种心血管疾病的调控途径。既往对于USP10的研究多与癌症相关，关于USP10在PAH中的研究尚少。为此，本研究2018年9月至2019年2月对USP10在低氧性PAH中表达的意义及对USP10-AMPK信号通路的调控作用进行探讨，以期为PAH的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，雄性，40只，6～8周龄，体重200～220 g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)2018-0034。

1.2 药物、试剂及仪器 USP10基因短发夹结构RNA慢病毒载体构建(上海吉凯基因化学技术有限公司)，水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司)，肝素钠(常州千红生化制药股份有限公司)，USP10鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK、磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化Akt(p-Akt)/Akt、磷酸化eNOS(p-eNOS)/内皮细胞型一氧化氮合成酶(endothelialnitric oxide synthase，eNOS)抗体(美国BD公司)，逆转录试剂盒(日本Takara公司)，BCA蛋白定量试剂盒(上海如吉生物科技发展有限公司)，辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)标记一抗(兔抗鼠)、HRP标记二抗(羊抗兔)、DAB显色试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)，SP免疫组化试剂盒、苏木素-伊红(hematoxylin and eosin HE)染色试剂盒、NanoDrop 2000紫外可见光分光度计(赛默飞世尔科技中国有限公司)，Prism7500实时荧光定量(polymerase chain reaction，PCR)仪(美国AIB公司)，Elx800酶标仪(美国Bio-Tek公司)，石蜡切片机(德国SLEE公司)，光学显微镜(日本NiKon公司)。

1.3 方法

1.3.1 低氧性PAH模型构建与干预 40只大鼠分随机分为4组，每组10只，分别为对照组、模型组、空载组和沉默组。以3 mL/kg 10%水合氯醛腹腔麻醉后固定于木板，止血钳牵拉舌尖，暴露声门，1.5×108TU/100 g量(USP10-lentivirus)分3次，缓慢滴入沉默组大鼠气管内，1次/d，滴注后向气道内注入少量空气并捏住鼻孔，促进大鼠呛咳使慢病毒流入肺部，空载组以等量的NC-lentivirus滴入，对照组与模型组以等量生理盐水滴入。滴入完毕待感染宿主3 d后，模型组、空载组和沉默组置于10%氧浓度的缺氧箱中饲养3周，间断缺氧8 h/d(密切观察大鼠生存情况，避免因急性缺氧而猝死)，对照组正常环境饲养(正常呼吸室内空气)，4组大鼠均放于同一房间予以相同饮食饲养。

1.3.2 一般情况观察及指标测量 观察4组大鼠干预期间的精神状态、活动量、毛色、呼吸变化。建模完成后各组大鼠以10%浓度水合氯醛(3 mL/kg)腹腔内麻醉，仰卧固定于木板，分离大鼠右侧颈外静脉，使用1.2-F压力测定导管，3%肝素钠冲洗后，从大鼠右侧颈外静脉、右心房、右心室进入肺动脉，取出管芯，连接PowerLab压力记录分析系统，测量平均肺动脉压(mean pulmonary arterial presure，MPAP)与右心室收缩压(right ventricular systolic presure，RVSP)。肺动脉压力测量后，实施气管插管，扎线固定注射器，右肺以丝线结扎。放血处死大鼠，2 mL 4%多聚甲醛经气管插管注入固定左肺，结扎左肺后取出，以4%多聚甲醛固定过夜。取出大鼠心脏，PBS缓冲液冲洗干净，剖开左心房和室间隔，以滤纸吸干后，电子天平分别称量右心室(right ventricle，RV)和左心室加室间隔(left ventricle pius septum，LV+S)，计算右心肥大指数(right ventricular hypertrophy index，RVHI)，RVHI= [RV/(LV+S)]。

1.3.3 病理学观察 大鼠肺脏组织标本行石蜡包埋切片，厚度4 μm，常规HE染色，中性树胶封片，于光学显微镜下观察肺动脉血管组织病理改变。以图像采集系统测量肺血管(直径<300 μm)管壁厚度，计算管壁相对厚度指数(relative thickness index，RTI)，RTI=(1-血管壁内径/血管外径)×100%。

1.3.4 肺组织USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相对表达量鉴定 取肺组织90 mg，Trizol法提取总RNA，逆转录试剂盒得到cDNA，RT-PCR检测相关基因的表达水平，Takara SYBR Green荧光定量试剂盒设定反应体系：Master Mix 10 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 10 μL；反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性25 s，60℃退火40 s，60℃延伸50 s，重复45个循环。β-actin为管家基因，2-ΔΔCt为目的基因的相对表达量。每个反应重复3次，取3次结果的平均值。各基因引物序列见表1。

1.3.5 肺组织USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS蛋白相对表达量鉴定 90 mg肺组织，Western blot法检测蛋白定量，取50 μg样本蛋白混合等体积上样buffer，100℃水浴5 min，离心取上清液，电泳分离后电转60 min将蛋白转至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后于室温孵育2 h，加入一抗(1∶800)，4℃摇床孵育过夜，TTBS液洗膜3次，二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，漂洗后暗室中曝光，计算肺组织中USP10蛋白相对表达量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值。

1.4 观察指标 (1)大鼠一般情况观察；(2)大鼠肺动脉血管组织病理改变；(3)各组MPAP、RVSP、RTI、RVHI对比；(4)各组USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相对表达量对比；(5)各组USP10蛋白相对表达量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值对比。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 造模期间，沉默组、模型组与空载组较对照组大鼠精神状态变差，活动量减少，毛发暗淡，口唇、眼眶发紫，呼吸急促，沉默组上述情况更为严重。

2.2 大鼠肺动脉血管组织病理改变 镜下观察，除对照组外，其余3组血管管壁增厚，管腔变窄，伴有平滑肌和弹力纤维层增厚，沉默组变化更为明显。见图1。

注：A：空载组；B：沉默组；C：模型组；D：对照组

2.3 各组MPAP、RVSP、RTI、RVHI对比 各组MPAP、RVSP、RTI、RVHI比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组、空载组、沉默组的MPAP、RVSP、RTI、RVHI均大于对照组(P<0.05)，沉默组各指标均大于模型组与空载组(P<0.05)，模型组与空载组各指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组MPAP、RVSP、RTI、RVHI比较

2.4 各组USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相对表达量对比 各组USP10 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，其余3组的USP10 mRNA相对表达量均下降(P<0.05)，沉默组均低于模型组与空载组(P<0.05)，模型组与空载组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各组的AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相对表达量对比

2.5 各组USP10蛋白相对表达量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值对比 各组USP10蛋白相对表达量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，其余3组的USP10蛋白相对表达量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值均下降(P<0.05)，沉默组均低于模型组与空载组(P<0.05)，模型组与空载组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表4。

图2 各组USP10、p-AMPK、AMPK、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS检测结果

表4 USP10蛋白相对表达量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值对比

3 讨论

肺血管阻力增加、收缩、弹性降低及血液黏稠度增加等情况下可导致肺动脉压力升高，肺小动脉和肌型小动脉出现解剖学变化，肺血管的顺应性下降、心输出量不足，并引起慢性阻塞性肺气肿、慢性肺源性心脏病及右心衰竭等并发症，对机体健康造成严重影响[6-7]。PAH是长期慢性积累的综合征，其病因多样，发病机制比较复杂，涉及细胞、液体因子及分子遗传等多个途径的病理生理过程[8]。研究显示[9]，肺动脉平滑肌细胞与内皮细胞的过度增殖、凋亡在PAH的发生、发展过程中有重要作用。而USP10参与细胞的分裂、增殖、凋亡等生命周期，并能通过USP10-AMPK信号通路参与心血管疾病的病理过程。因此了解USP10在低氧性PAH中的表达及USP10-AMPK信号通路的调控作用，对于PAH的防治有重要意义。

在细胞内的生理调控机制中，蛋白质的泛素化修饰是基本调控机制，参与某些重要蛋白质的修饰后翻译、细胞周期DNA的修复、信号转导、转录活化等多种生命进程[10]。泛素化与去泛素化对于维持蛋白质的稳态和细胞存活有重要意义，泛素-蛋白酶途径是真核细胞内蛋白质降解的重要途径，对于维持蛋白质的稳态和细胞存活有重要意义，广泛参与机体的多种代谢活动。USP10是USP家族中的重要成员之一，分子功能为半胱氨酸型内肽酶和泛素巯基酯酶，参与泛素依赖的蛋白质分解代谢及泛素周期的生命过程，能通过本身的去泛素化，调控细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、细胞免疫及神经元退化等多种生物学功能[11]。研究显示[12-13]，USP10的蛋白下调能影响宫颈鳞癌的恶性程度及预后，参与调节肝脏脂肪变性、胰岛素抵抗及炎症反应。彭清等[14]研究证实，包括USP10、USP7等USP家族成员在内的异常表达及活性改变，参与多种疾病及肿瘤的发生发展，可参与上皮细胞-间充质改变，促进肺纤维化的形成。本研究结果中，与模型组和空载组大鼠相比，USP10沉默组大鼠的临床指征较为显著，肺血管管壁增厚、管腔变窄，平滑肌和弹力纤维层增厚情况更为严重，RTI指数更高，同时，USP10沉默组大鼠MPAP、PVR、RVHI等指标均显著高于模型组和空载组。以上结果说明沉默USP10可促进低氧性PAH的发展，影响大鼠的心室重构。

低氧性PAH是PAH最常见的类型，研究显示[15]，早期低氧性肺动脉收缩反应与后期合并肺动脉结构重建是PAH发病的重要环节。长期的低氧条件能影响大鼠肺微血管内皮细胞生成一氧化氮(nitric oxide，NO)，导致血管内皮舒缩障碍、血管内皮功能损伤，进而促进肺动脉血管的重建。eNOS是合成NO的关键酶，其活化能促进NO的合成，促进血管的舒张，抑制血管内皮功能失调[16]。AMPK是一种高度保守的细胞能量代谢调控器，由催化亚基(α1、α2、β1、β2)和调节亚基(γ1、γ2、γ3)组成，在各种代谢相关的器官中均有表达，能被机体各种刺激激活，并磷酸化激活大量的下游靶分子，减少三磷酸腺苷的利用，影响细胞内能量代谢。研究显示[17]，USP10特异性地去除AMPKα的泛素化，促进AMPKα磷酸化，在能量胁迫下，通过AMPK介导的USP10 Ser76磷酸化，增强USP10的活性，USP10与AMPK形成了一个关键前馈环路，保证了AMPK激活响应于细胞能量状态的波动而放大响应细胞能量状态的波动，因此USP10-AMPK通路的异常可导致AMPK激活不正常和多种代谢缺陷。另有研究表明[18]，AMPK信号通路的失调能影响NO的生成，促进内皮功能障碍的发展。PI3K/Akt是具有代表性的增殖、迁移、归巢相关信号转导通路，PI3K的激活可诱导Akt的活化其下游信号分子eNOS的丝氨酸磷酸化，促进NO的合成，从而介导内皮细胞的迁移[19]。左晓利等[20]认为，AMPK的活化可磷酸化eNOS Ser1177位点，促进NO的合成与释放，改善血管内皮功能。AMPK及其下游级联PI3K-Akt-eNOS对于内皮细胞具有重要的调控作用，内皮细胞通过AMPK/PI3K/Akt/eNOS通路生成NO，维持血管舒张。本研究结果中，与对照组比较，各组的USP10 mRNA、蛋白相对表达量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-eNOS/eNOS蛋白比值均下降；与模型组及空载组比较，沉默组的USP10 mRNA、蛋白相对表达量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-eNOS/eNOS蛋白比值更低，说明沉默USP10，能抑制AMPK/PI3K/Akt/eNOS信号级联，促进低氧性PAH的发展。

综上所述，USP10在低氧性PAH中的表达下调参与病情的进展，其机制可能与抑制AMPK/PI3K/Akt/eNOS信号通路有关。在今后对PAH的基因治疗研究中，可考虑从AMPK/PI3K/Akt/eNOS信号级联激活入手。