姜黄素对肾癌ACHN细胞增殖与凋亡的影响及作用机制*

陈烈钳, 谢进东, 黄栋强, 陈景宇

惠州市第一人民医院泌尿外科(广东惠州 516000)

肾脏肿瘤是泌尿系统主要疾病之一，其中90%是恶性的，又称为肾细胞癌(RCC)。RCC是成人常见的恶性肿瘤，并且发病率逐年增加[1]。尽管肾癌早期患者通过手术治疗后愈后效果较好，但患有复发性或新发转移性疾病的患者通常无法治愈并且需要全身治疗。此外，由于RCC具有多种耐药基因，使其对放疗、化疗均不敏感。因此，找到低毒性并具有高效抗癌作用的活性物质成为目前的研究热点。姜黄素是一种从姜科植物的根茎中提取得到的黄色色素，为酸性多酚类物质，主链为不饱和脂族及芳香族基团[2]。研究发现姜黄素可以抗氧化、抑制炎症反应、抗动脉粥样硬化、抗类风湿、降脂、抗衰老、消除自由基及抗肿瘤等作用[3]。近年来，越来越多的研究证明，Notch信号通路参与多种肿瘤生物学行为的调控，包括肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和基因组稳定性。一些研究已经证实，Notch1蛋白及其mRNA在RCC组织中的表达高于邻近组织[4]。另外有研究表明，姜黄素作用于ACHN细胞后，细胞出现密度降低，细胞形态缩小，变圆等凋亡的特征[5]。因此，我们于2019年3月至2020年12月开展实验研究姜黄素作用于肾癌ACHN细胞后对其增殖及凋亡的改变，探讨其影响凋亡的可能机制，为肾癌治疗的新方向提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料 肾癌ACHN细胞购自上海生物化学与细胞生物学研究所，由本实验室传代培养和冻存。姜黄素购自碧云天生物公司，溶解于二甲基亚砜(DMSO)；MEM培养基及胎牛血清购自美国Gibgo公司; Cell Counting Kit-8试剂盒购自日本Dojindo公司；CO2细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司；流式细胞仪购自美国BD公司；多功能酶标仪购自美国BioTek公司；活性氧检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术所；Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司；Bcl-2抗体、Caspase-3抗体及GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞株的培养与传代 ACHN细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基培养，置于37℃、5% CO2恒温培养箱中，每2 d更换新鲜培养基，当细胞铺满80%培养板以上时利用1%胰蛋白酶进行消化及传代。

1.2.2 细胞增殖测定 取对数生长期的ACHN细胞，胰酶消化、离心后按照5×103个/孔的细胞密度接种于96孔板，100 μmol/L，四周边缘用PBS填充，置于恒温培养箱内孵育24 h后，分别以0、10、20、40、80 μmol/L 姜黄素处理ACHN细胞，每个剂量设5个复孔，同时分别设置溶剂对照组(10、20、40、80 μmol/L姜黄素)及不加细胞和药物的空白对照组(0 μmol/L)。分别处理12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37℃避光温育2 h，全自动酶标仪测量450 nm波长处各孔的吸光度(A)值，计算细胞增殖情况，独立重复试验3次。

1.2.3 细胞凋亡测定 取对数生长期的ACHN细胞，胰酶消化、离心后计数，按照5×105个细胞/皿的密度接种细胞至60 mm培养皿中，预培养24 h后分别加入不同浓度(0、20、40、80 μmol/L)的姜黄素继续培养24 h。预冷PBS小心洗涤2遍，弃上清，按照试剂盒说明加入500 μL的Binding Buffer重悬细胞；加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混匀；室温下避光反应10 min后上流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.4 蛋白表达水平检测 胰酶消化、离心后计数，按照5×105个/皿接种细胞至60 mm培养皿中，预培养24 h，分别加入不同浓度(0、20、40、80 μmol/L)姜黄素，继续培养24 h后收集处理后的ACHN细胞，预冷的PBS洗涤细胞2次，向离心管中加入 100 μL的细胞裂解液超声处理，4℃，14 000×g离心10 min；收集上清取5 μL测定其总蛋白浓度，剩余部分按照4∶1比例加入5×SDS，充分混匀，100℃煮沸5 min。配制SDS-PAGE分离胶和浓缩胶，进行凝胶电泳；电泳后，半湿转法转移至PVDF膜上，放入5%的脱脂奶粉，置于摇床上，室温封闭1 h。以TBST为稀释液配置一抗(Bcl-2、Caspase-3、GAPDH)，4℃过夜。次日用 0.1% TBST 液洗膜3次，加入相应二抗，置于摇床上，1 h后再次洗膜3次后，铺于曝光黑板上，将混匀的化学发光底物均匀滴在 PVDF膜上，置于曝光机中进行曝光。观察结果，每个实验重复3次。

1.2.5 Real-time PCR测定ACHN细胞中Notch1基因表达量的变化 收取细胞后，用试剂盒提取RNA,并用反转录试剂盒聚合为cDNA，以提取的细胞中cDNA位模板，进行qPCR反应，Notch1 F:5′-CCTTTGTGCTTCTGTTCTTCG-3′,Notch1 R:5′-CCACTCATTCTGGTTGTCGTC-3′，212 bp；GAPDH F:5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，GAPDH R:5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′，532 bp。反应在罗氏Light Cycler® 480 PCR仪上运行，PCR反应参数: 94℃ 1 min；98℃ 10 s，60℃ 10 min，共30个循环；72℃ 10 min，4℃ forever。

2 结果

2.1 姜黄素对ACHN细胞增殖的影响 姜黄素作用后ACHN细胞增殖速度明显降低，且抑制作用呈时间及浓度依赖性(P<0.05)，即随着姜黄素浓度的增加，细胞增殖减慢；在相同浓度的姜黄素作用下，随着时间延长，细胞抑制率越高。见图1。

图1 不同浓度姜黄素对ACHN细胞增殖的影响

2.2 姜黄素对ACHN细胞调亡的影响 随着姜黄素浓度的增加，凋亡细胞数量占比越多，即姜黄素作用后可促进ACHN细胞的凋亡，且凋亡率呈现出明显的剂量依赖关系(P<0.01)。见图2、表1。

表1 不同浓度姜黄素对ACHN细胞凋亡的对比

图2 不同浓度姜黄素对ACHN细胞凋亡的影响

2.3 姜黄素对ACHN细胞调亡相关蛋白表达的影响 随着姜黄素浓度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3则表达增加，Notch 1蛋白表达增加。见图3。

图3 不同浓度姜黄素处理ACHN细胞24 h后相关蛋白表达水平

2.4 姜黄素对ACHN细胞中Notch1基因表达量的影响 不同浓度不同时间姜黄素作用后ACHN细胞中Notch1基因表达增加，且表达量呈时间及浓度依赖性(P<0.05)，即随着姜黄素浓度的增加，Notch1基因表达增加；在相同浓度的姜黄素作用下，随着时间延长，Notch1基因表达增加越多。见图4。

图4 不同浓度姜黄素对ACHN细胞Notch1基因表达的影响

3 讨论

肾癌是泌尿系统常见肿瘤之一[6]，世界卫生组织(WHO)下属机构发布的2018年全球肿瘤流行病统计数据(GLOBOCAN 2018)表明肾癌在男性和女性的恶性肿瘤中的排名分别为第6位和第10位，占2018年所有新诊断癌症的5%和3%[7]。肾癌患者早期无明显症状，大约30%的患者就诊时已是转移性肾癌。研究证实肾癌对化疗、放疗及激素治疗等均不敏感，且治疗愈后较差[8]。近年来，越来越多的研究致力于寻找治疗肾癌新的有效药物。

1985年姜黄素首次被发现具有较强的抗肿瘤作用，并引起广泛关注及研究[9]。姜黄产于东南亚，隶属于姜科家族，具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗肝纤维化、调脂和抗动脉粥样硬化等，且具有毒性低、不良反应少的特点[10]。现代的研究发现姜黄素具有抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡和减少瘤体数量、减慢瘤体增长的作用，从肿瘤发展的多个环节和步骤发挥抗肿瘤效应[11]。

本研究利用CCK-8试剂盒检测不同浓度姜黄素处理肾癌ACHN细胞不同时间后细胞增殖变化，结果表明姜黄素可以抑制肾癌ACHN细胞的增殖，且抑制作用呈时间及浓度依赖性。利用流式细胞仪检测发现姜黄素可诱导肾癌ACHN细胞凋亡，同时凋亡率随姜黄素浓度的增加而上升，该结果表明姜黄素可抑制肾癌ACHN细胞的增殖，并促进该细胞的凋亡，这与既往关于姜黄素对癌细胞的作用的研究[2, 12]结果相一致。

当前，Notch信号转导途径是生命科学领域中的热点问题。在RCC中，Notch1受体蛋白将被重新表达，以增加RCC细胞的增殖。随着RCC的病理分级，临床分期和肿瘤的增加，Notch1的表达水平将进一步升高[13]。研究表明，Notch1受体在肿瘤血管中高表达，对肿瘤的增殖有一定的作用[14]。RCC中Notch1信号的异常激活，这种异常激活的Notch1信号蛋白可以通过激活PI3K-Akt和NF-κB信号通路来促进G1-S期RCC细胞增殖和细胞周期进程[15]。

有研究表明，肾脏透明细胞癌中Notch1和Notch信号通路的其他蛋白的阳性表达率研究表明，肾脏透明细胞癌组织中Notch1和Notch信号通路的其他蛋白的阳性表达率高于正常人[16]。肾组织，并与临床参数如肿瘤的病理分级和大小密切相关，提示Notch1对肾癌具有重要的诊断和预后意义[17]。此外，研究表明，Notch1在肾癌细胞Caki-1和786-0中的表达明显高于正常肾小管上皮细胞HK-2，并且干扰Notch1的表达可显着降低Caki-1细胞的生存能力，但具体的作用机制尚无报告[18]。根据张震等[19]的研究结果，Notch1在肾癌细胞中的表达明显高于HK-2细胞，提示Notch1在肾癌组织中可能具有促癌作用。此外，尚春香等[20]研究表明，下调肾癌细胞Caki-1中Notch1的表达可显著降低细胞活力并诱导细胞凋亡，细胞癌组织高于正常肾组织，且与临床参数如肿瘤的病理分级和大小密切相关，提示Notch1对肾癌的诊断和预后意义重大。本研究为探讨姜黄素在促进肾癌ACHN细胞凋亡中Notch1基因表达水平改变，Real-time PCR、Western blot检测结果显示Notch1基因表达增加，且表达量呈时间及浓度依赖性。

在多细胞生物中，细胞凋亡是发展和维持组织稳态的一个重要的进化保守机制，它在癌细胞中受到干扰。细胞凋亡可导致细胞特性的某些变化，包括活化Caspases、线粒体去极化和DNA断裂等。

线粒体是细胞呼吸能量中心，也是细胞凋亡的调控中心。线粒体能通过不同的信号转导方式感受来自细胞内外的刺激，在相关蛋白的调节下，线粒体的膜通透性发生改变，从而释放出相关的促凋亡因子。Bcl-2 家族蛋白就是其中最为关键的一种，该家族蛋白能够形成同源二聚体或异源二聚体，通常分为两大类：一类是抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-x)，另一类则是促凋亡蛋白(如Bax、BAK)。而抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比值关系，与细胞线粒体膜通透性的调节具有重要的相关性[21-22]。Caspase 位于细胞质中，可选择性切割某些蛋白质，其中凋亡相关性 Caspase 包括凋亡效应亚类(如Caspase-3)及凋亡启动亚类(如Caspase-9)。凋亡过程中引发 Caspase 活化的主要途径有两条，包括线粒体调控通路(内源性凋亡)和细胞死亡受体介导通路(外源性凋亡)[23-24]。有学者发现姜黄素可以通过、下调 Bcl-2、上调Bax，继而影响Bcl-2与Bax的比值，激活Caspase-3的表达，从而诱发肿瘤细胞凋亡的发生[22, 25]。本研究采用Western blot检测不同浓度姜黄素处理ACHN细胞后Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表达改变。实验结果表明 姜黄素作用于ACHN细胞后，随着其浓度的增加，凋亡执行蛋白酶Caspase-3表达增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2的表达减少。研究结果提示姜黄素促进ACHN细胞凋亡可能是通过提高细胞内Notch1基因的表达，增加Bax、Caspase-3的表达，下调Bcl-2蛋白水平来实现的。

综上所述，姜黄素通过促进ACHN细胞中Notch1基因的表达，上调 Bax、下调 Bcl-2蛋白的表达，从而激活Caspase-3表达，促进ACHN细胞凋亡的发生，因此猜想Notch1基因可以促进ACHN细胞凋亡，而其中详细的凋亡机制还需进一步研究。