MR定量磁敏感图评估大鼠肩胛区棕色脂肪代谢活性的价值*

祝翠玲, 郭义昊, 钟俏玲, 斯文彬, 蔡子萌, 余琴琴, 余可妍, 冯衍秋, 张晓东△

1南方医科大学第三附属医院、广东省骨科研究院影像科(广东广州 510630)； 南方医科大学 2生物医学工程学院， 3基础医学院(广东广州 510515)

肥胖是一项重大的全球公共卫生问题，过度肥胖将导致糖尿病、血管性疾病、心脏功能障碍或其他代谢相关性疾病[1-2]。棕色脂肪(brown adipose tissue， BAT)在肥胖症的病因和治疗中起作用，因为其线粒体中存在特异性的解偶联蛋白1(uncoupling protein1，UCP1)，能将呼吸链与ATP合成解偶联，消耗脂质或葡萄糖释放热量，从而改善糖、脂代谢，预防肥胖的发生，因此准确检测及定量分析未激活与激活状态的BAT对治疗肥胖等代谢性疾病具有重要意义。通过暴露于寒冷环境中来刺激啮齿类动物肩胛区的BAT促进非颤抖性产热反应被认为是降低三酰甘油和对抗肥胖的一种手段[3]，同时冷刺激也是激活BAT最简便的一种方法。由于BAT激活后细胞和组织水平会发生一些改变，包括富含铁的线粒体含量增加、血液灌注的增加以及脂质的减少[4]， 因此可利用这些特性对BAT进行定量分析，脂肪分数(fat fraction，FF)和R2*(1/T2*)最常应用于脂肪的定量分析。这些定量指标虽然应用广泛，但仍存在许多不足，寻找一种准确有效且能反映BAT代谢活性的方法至关重要。定量磁敏感图(QSM)可定量检测组织磁化率的变化，QSM计算所得的磁化率数值能反应组织在磁场中被磁化的程度，且对组织铁含量变化比较敏感[5-7]。但目前使用QSM来定量检测BAT的代谢活性鲜有报道。2019年3—12月，本研究基于BAT代谢活性的变化可引起QSM值的改变，初步探讨QSM值定量评估活体大鼠BAT代谢活性的可行性，为肥胖及其代谢相关性疾病的诊疗提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，6周龄，体重200～250 g)，购于南方医科大学实验动物中心。实验动物的使用获得南方医科大学动物实验伦理会批准。

1.2 冷刺激组与对照组 待大鼠适应环境1周(自由饮水饮食，动物房内温度(23±2)℃，昼夜节律为12 h/12 h)后，按照随机原则将大鼠随机分为冷刺激组和对照组。冷刺激组：5只SD大鼠独立装入鼠笼内，暴露于低温实验冷柜中(海尔，中国)，冷柜内温度4℃，暴露12 h。另外5只对照组大鼠在动物房内饲养。在冷暴露过程中，所有大鼠禁食、禁水。

1.3 磁共振扫描 采用7.0T Bruker小动物磁共振成像设备，使用具有以下参数的4通道头线圈的三维多回波梯度回波序列：TR=50 ms；TE1/ΔTE/#TE=1.7 ms/1.3 ms/10；矩阵大小=[90×90×60]；体素大小=[0.4 mm×0.4 mm×0.4 mm]，翻转角度=[20°]。采用呼吸门控并使用同相回波(第2、第5、第8回波)计算初始R2*图和场图。然后利用R2*-IDEAL序列所得到的R2*图和场图初始化，利用所有的回波得到水图、脂肪图、R2*图和场图。QSM重建使用Matlab软件包对采集到的数据进行后处理，首先对场图解缠绕,然后利用去除背景场和偶极子反演技术，由最终的场图计算得到。

1.4 勾选感兴趣区(ROIs) 采用ITK-SNAP软件选取3D ROIs，BAT的ROIs是在大鼠肩胛区的FF图上手动绘制的，避开周围的血管，从最大层面开始依次勾画3层，然后将其应用在QSM图、R2*图中。计算出定义在ROIs内QSM值(ppb)和R2*值(s-1)的平均值。

1.5 组织取材及处理 MRI扫描结束后，立即采用颈椎脱位法处死实验动物，将每只小鼠背侧朝上，用剪刀从背侧向颈部剪开，小心地提起皮肤，向左右前肢各开1个切口，仔细的切开皮肤并分离出BAT；一部分组织立即冷冻在液氮中，随即转移到-80℃冰箱中保存备用；一部分组织用4%多聚甲醛(PFA)在4℃固定24 h，石蜡包埋样本后续制备病理切片。

1.6 免疫组织化学检测大鼠BAT UCP-1蛋白的表达 从-4℃冰箱中取出切片，室温放置1 h，放入烤箱(65℃)中烤片1 h，然后进行脱蜡水化，PBS清洗3次；将切片置于已经煮沸的枸橼酸钠中高火过夜，修复抗原，PBS洗涤，使用免疫组化笔画圈防止液体外溢；滴加3%的过氧化氢避光封闭，PBS洗涤3次； 5%(v/v)山羊血清室温封闭30 min；甩掉玻片上残余的液体，滴加稀释的一抗(兔抗鼠UCP-1)孵育，4℃过夜；次日除去玻片上的一抗液体，使用PBS清洗，滴加羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h；PBS洗3次，滴加辣根酶标记的工作液孵育15 min，使用PBS洗3次；弱光下进行室温DAB显色，使用显微镜来控制显色程度，纯水轻轻冲洗，用苏木素复染然后在分化液中返蓝；使用不同浓度梯度的乙醇进行脱水，然后二甲苯透明和中性树胶封片。采用Image Pro Plus6.0软件在400倍图片上随意选择5个区域测量光密度(IOD)，然后取平均值，最后对结果进行半定量分析。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.3软件，首先对冷刺激组(n=5)与对照组(n=5)的QSM值、R2*值和UCP-1半定量值分别进行检验以验证数据是否符合正态分布，再进行独立样本t检验。所有数据均以均数±标准差表示，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 影像学表现 对照组与冷刺激组的FF图、QSM图、R2*图分别见图1、2，FF图中红箭头及QSM图中蓝色轮廓显示大鼠肩胛区BAT，R2*图显示BAT轮廓不如QSM图。在FF图及R2*图中，冷刺激组相对于对照组的BAT信号暗一些。在QSM伪彩图中，可以看到对照组BAT为黄色，冷刺激组BAT为青色，提示QSM值的降低，这与我们定量测量的结果一致。

图1 对照组的FF图、QSM图及R2*图

图2 冷刺激组的FF图、QSM图及R2*图

2.2 不同组间磁共振参数数值比较 冷刺激组的R2*值、QSM值明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 不同组间各参数测量结果比较

2.3 免疫组化染色结果 冷刺激组可见大量阳性表达颗粒，对照组可见弱阳性，见图3。UCP-1在对照组和冷刺激条件下均可见到高密度的胞质染色，部分由于冷刺激的BAT中脂质含量明显降低，使总胞质UCP-1含量有所升高所致。对照组的UCP-1半定量值为478.46±446.14，冷刺激组为1 762.15±1 005.74，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 两组的UCP-1免疫组织化学染色图(×200)

3 讨论

QSM能够较准确、真实地反映组织磁化率的空间分布情况，已经很好地应用于量化大脑和肝脏内的铁沉积[8-10]、鉴别钙化和出血[11]以及评估脊柱的骨质疏松[12]。QSM值的变化受顺磁性物质铁的积累、顺磁离子氧化态和抗磁性物质的共同影响。在本项研究中，我们根据MR定量参数(QSM值、R2*值)的差异区分BAT的代谢状态，并结合组织学分析来评估QSM作为这些过程的潜在生物标记的可能性。

BAT的数量增多或活性增加是治疗肥胖、糖尿病等代谢性疾病的关键因素。然而，BAT在人体内数量有限且分散，因此BAT代谢活性的测定至关重要。BAT中存在大量富含铁的线粒体，铁是人体内非常重要的一种微量元素，在机体的氧气运输和细胞的有氧代谢过程发挥着巨大作用，铁亦是构成电子传递链的线粒体内膜复合物的基本成分，因此在能量代谢中是必需的。已知将实验动物置于低温环境中将导致BAT的细胞和组织发生改变，激活后的BAT代谢活性增加，脂肪含量降低、线粒体内铁含量及耗氧量增加(脱氧血红蛋白)[13-15]，因此先前很多研究者利用这些生理特性，多采用通过测量FF和R2*(1/T2*)的方法来定量BAT，但由于肩胛区BAT和白色脂肪常常混合存在，FF体现的可能是两者混合的脂肪区域的总体脂肪分数，且相对脂肪细胞本身的大小MR所用体素大的原因，仅用BAT的FF作为绝对或者单一评估BAT代谢活性的指标是不准确的；另一种磁共振参数是R2*，该参数对铁的存在也很敏感，然而在磁化率差异较大的组织界面(如空气与软组织、颅底骨气交界处)以及一些微观结构的检测时，R2*受影响较大，R2*亦与磁场强度有关，在高场强下信号衰减快，因此会导致测量不准确。有学者[16]利用R2*对人体锁骨上区域BAT的代谢活性进行评估，发现R2*不仅受到线粒体中铁的影响，而且还受到组织灌注变化的影响，R2*值在这个过程中是动态变化的[17]，而且可重复性差，因此R2*的测量可能不足以准确地可靠地量化BAT的代谢活性。

在这项研究中，我们采用单次3D多回波梯度回波序列(mGRE)提取定量参数图R2*并利用去除背景场和偶极子反演技术，从B0场计算出QSM，大大缩短了扫描时间并减少由此产生的运动伪影。我们在BAT是否接受冷刺激的状态下，使用QSM来对其进行测量和量化，为了激活BAT，我们将实验动物暴露在4℃寒冷环境下12 h。本组资料结果显示，在冷刺激条件下，BAT的QSM值、R2*值均低于对照组，与Ghassaban等[18]的研究中铁含量的增加导致QSM值增加不一致，可能因为在这个过程中铁的变化不明显而脂肪含量变化显著。已有研究表明，冷刺激后的BAT脂肪含量较低，水分含量相对较高[19-20]，而脂肪作为一种额外的化学物质相对于水来说具有顺磁性[21]而影响对组织磁化率的精确估计。本研究中冷刺激组由于脂肪含量明显降低导致顺磁性物质减少，而线粒体中顺磁性的铁含量增加不足以补偿脂肪减少所产生的效应，因此QSM值、R2*值较对照组减小；另一方面我们无法保证实验动物在MR扫描期间继续暴露在低温下，温度的变化可能会影响BAT血流动力学的改变，使组织的磁化率发生变化，尚需要进一步深入研究。

此外，本研究的免疫组化UCP-1半定量分析结果显示，冷刺激组UCP1蛋白表达较对照组增加，与以往文献[13，22]结果一致，说明UCP-1的含量与其代谢活性关系密切；两组之间统计学结果有差异，但差异不够显著提示本研究中BAT可能尚未完全激活，且在MR扫描过程中没有对环境温度加以控制。然而，不管BAT有没有接受冷刺激均表达UCP1蛋白，因此我们使用免疫组化染色对该蛋白进行分析，结果两组均可见到胞质阳性染色颗粒，证明我们评估的是真正的BAT。我们认为UCP-1蛋白水平在不同冷刺激方案的变化与BAT的激活状态有关，在未来的研究中，可以设计慢性间歇冷刺激[23]对暴露在较长时间的寒冷环境中的多参数指标进行动态测量以求得更准确的数据。

在我们的研究中可以看到QSM图显示BAT的区域较R2*图清晰，QSM值的组间差异性比较也较R2*值大，QSM受微观磁化率分布的影响较小，对脂肪和铁含量的变化比较敏感，克服了磁场分布的不均匀性并提供定量和局部解剖学对比，在评估BAT的代谢活性方面较R2*优越。以往多个研究亦表明QSM比R2*定量分析铁更可靠[6，24]。

本研究存在一些局限性：(1)本次数据的样本量，可能会影响统计检验的强度和对结果的合理解释。因此，结果仍需要更大的样本量来进一步确认；(2)ROI放置位置及大小、形态的选择可能会对结果造成一定影响；(3)急性冷刺激激活BAT可能不如间歇性冷刺激有效，利用间歇性冷刺激可能有助于区分铁对磁化率的贡献；(4)没有测量组织中铁的含量，不能从生理学角度对BAT进一步分析；(5)本研究仅限于组间比较，并未探究纵向动物活体成像潜能，未来的研究将集中于纵向测量单个动物活体成像变化的能力，并做好重复性验证。

综上所述，利用单个三维多回波梯度回波序列得到QSM来评估不同代谢状态下的BAT代谢活性是可行的，提示QSM值可以作为一个非常有潜力的研究BAT的生物学标记。QSM不仅能够对BAT进行定量，还能够识别在R2*图上部分不明显的BAT区域的轮廓。因此，可以预期QSM有可能作为一种新的非侵入性工具来评估伴随着代谢活性改变的BAT。