miR-211对高糖诱导下晶状体上皮细胞氧化应激反应的调控作用*

孟娜, 顾悦, 孔瑞芹, 王瑛璞

1河南科技大学第二附属医院眼科(河南洛阳 471000)； 2西安医学院第二附属医院眼科 (陕西西安 710038)

糖尿病性白内障(diabetic cataract, DC)是糖尿病患者致盲的一个重要因素。糖尿病患者血糖浓度始终处于异常高水平状态，长期的高糖环境引起晶状体上皮细胞(lens epithelial cells，LECs)的氧化应激损伤是高糖环境下晶状体浑浊的主要原因之一，细胞内过量的ROS及晶状体内抗氧化物酶失活，导致晶状体细胞抗氧化能力下降。是引起糖尿病患者视力低下的主要原因[1-2]。miRNA是一类内源性非编码单RNA分子，可通过调控下游靶基因的转录和翻译进而参与白内障发生及发展过程[3]。近年来发现多种miRNA在LECs的氧化应激损伤中发挥作用，参与白内障的发生、发展[4-5]。miR-211是miRNA家族成员，有研究发现，miR-211在白内障患者晶状体组织中呈高表达，且能促进LECs的凋亡[6]。2019年2—6月，本研究探讨miR-211对高糖诱导的LECs氧化应激的影响及其可能的作用机制，为白内障的防治寻找潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 永生型人LECs HLEC-B3细胞株(中国科学院上海细胞库)；含双抗的1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(杭州四季青公司)；miR-211抑制剂(miR-211 inhibitor)和miR-211阴性对照(miR-211 NC)(上海吉玛基因公司)；LipofectamineTM2000(美国Sigma公司)；Trizol(杭州四季青公司)；SIRT1、FoxO3a一抗(美国Invitrogen公司)；山羊抗兔IgG(H+L)二抗(美国Sigma公司)总抗氧化能力(total-antioxidative capability, T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutas, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、还原型谷胱甘肽(glutathone, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒(上海碧云天有限公司)。

酶标仪(美国 Biorad 公司)，实时定量PCR仪(美国ABI 7500)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞复苏与培养 将HLEC-B3细胞株解冻、复苏，用含10%FBS和1%双抗的1640培养基重悬细胞，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每2～3 d用胰蛋白酶消化传代1次。取对数期细胞进行后续实验。

1.2.2 高糖诱导HLEC-B3细胞氧化应激模型的制备 取对数期细胞，待细胞融合近80%时，用含1%FBS的1640培养基，与不同浓度的葡萄糖供培养，按照葡萄糖浓度的不同分为4组：0 mmol/L组、10 mmol/L组、20 mmol/L组、40 mmol/L组，于培养箱中继续培养48 h。

1.2.3 细胞转染 取对数期HLEB-3细胞，用含1%FBS的1640培养基重悬，将细胞接种于6孔板，调整细胞密度为2×105个/孔，按照转染试剂LipofectamineTM2000说明书中所示步骤，将miR-211 inhibitor和miR-211 NC分别转染至HLEB-3细胞，转染6 h后，将各组细胞转移至含40 mmol/L的培养基继续培养48 h。

1.2.4 RT-PCR RT-PCR检测各氧化应激模型组细胞内miR-211表达。将HLEC-B3细胞于不同浓度葡萄糖共培养48 h后，收集各组细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录试剂盒得到cDNA，RT-PCR检测相关基因的表达水平，Takara SYBR Green荧光定量试剂盒设定反应体系：Master Mix 10 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 10 μL；反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性25 s，60℃退火40 s，60℃延伸50 s，重复45个循环。β-actin为管家基因，2-ΔΔCt为目的基因的相对表达量。每个反应重复3次，取3次结果的平均值。内参β-actin引物序列：F:5′-TAGGCTTAGGCTAGGCTTAC-3′，R:5′-CTAGGCTTAGCTAGGCCACT-3′，miR-211引物序列：F:5′-CGTTGACGGTAGCTAACAGT-3′，R: 5′-TAGGTTCGATGGCTACGCAT-3′。每个实验结果独立重复3次。

1.2.5 Western blot Western blot检测各氧化应激模型组细胞内SIRT1蛋白表达，各转染组细胞内SIRT1、FoxO3a蛋白表达。

RIPA裂解液提取总蛋白，加入SDS-PAGE凝胶加样孔进行电泳，使蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶室温封闭2 h，TBST温和洗膜3 min后加入相对应的一抗：Nrf2(1∶1 000)、γ-GCS(1∶500)、HO-1(1∶1 000)，54℃孵育过夜，TBST洗涤10 min×3次，加入相应二抗(1∶2 000)，室温下孵育1 h，TBST洗涤10 min×3次，加入配制好的ECL发光液，避光孵育5 min，化学发光凝胶成像仪中采集图片信息，图片用Image pro plus 6.0软件进行灰度分析，以β-actin为内参，分析目的蛋白条带灰度。每个实验结果独立重复3次。

1.2.6 T-AOC、SOD、GSH-PX及MDA活性的检测 采用相应试剂盒说明书中的步骤测定各氧化应激模型组细胞及各转染组细胞内T-AOC、SOD、GSH-PX、GSH和MDA活性。每个实验结果独立重复3次。

2 结果

2.1 氧化应激模型HLEB-3细胞中miR-211和SIRT1表达 与0、10、20、40 mmol/L葡萄糖共培养48 h后，HLEB-3细胞中miR-211的表达随着葡萄糖浓度的升高而增加，SIRT1的表达随着葡萄糖浓度的升高而降低，差异有统计学意义(FmiR-211=7.271,P<0.001；FSIRT1=10.571,P<0.001)。见图1。

注：A、B：RT-PCR检测HLEB-3细胞中miR-211相对表达量；C、D：Western blot检测HLEB-3细胞中SIRT1相对表达量。*与0 mmol/L组比较 P<0.05；△与10mmol/L组比较 P<0.05；▲与20 mmol/L组比较P<0.05

2.2 氧化应激模型HLEB-3细胞中T-AOC、SOD、GSH-PX、MDA浓度 与0、10、20、40 mmol/L葡萄糖共培养48 h后，HLEB-3细胞中T-AOC、SOD和GSH-PX浓度随葡萄糖浓度的升高而降低，MDA浓度随着葡萄糖浓度的升高而增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 葡萄糖所致氧化应激模型HLEB-3细胞中氧化应激指标水平 d

2.3 不同转染组HLEB-3细胞中T-AOC、SOD、GSH-PX、MDA浓度 不同转染组细胞与葡萄糖40 mmol/L葡萄糖共培养48 h后，miR-211 inhibitor组细胞内T-AOC、SOD、GSH-PX浓度显著高于miR-211 NC组，MDA浓度显著低于miR-211 NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同转染组HLEB-3细胞在葡萄糖所致氧化应激模型中氧化应激指标水平

2.4 不同转染组HLEB-3细胞中SIRT1、FoxO3a蛋白表达 不同转染组细胞与葡萄糖40 mmol/L葡萄糖共培养48 h后，miR-211 inhibitor组细胞内SIRT1蛋白表达显著高于miR-211 NC组(t=15.641,P=0.000)，FoxO3a蛋白表达显著低于miR-211 NC组，差异有统计学意义(t=9.823,P=0.000)。见图2。

注：*与miR-211 NC组比较P<0.05

3 讨论

LECs是晶状体代谢最活跃的部位，可产生晶状体纤维，维持整个晶状体的代谢，对维持晶状体的透明性有重要作用[7]。miRNA在白内障中的作用越来越受到关注，miR-211是近年来广泛研究的一个miRNA，研究证实，miR-30a对视网膜病变和白内障的发生有调控作用：Zeng[6]和Lu[8]等报道，miR-211在糖尿病性白内障晶状体组织中呈高表达，在高糖诱导的HLEB-3细胞氧化应激模型中，miR-211呈现高表达，miR-211能促进LECs的凋亡，抑制其增殖；本研究检测了miR-30a在与高糖共培养的LECs中的表达，结果发现，经过葡萄糖刺激后，HLEB-3细胞内miR-30a表达随着葡萄糖浓度的升高而降低，这一结果与文献报道一致，提示miR-211在糖尿病性白内障中可能作为致病基因发挥作用。

糖尿病性白内障的发病与晶状体抗氧化应激体系的紊乱有关。高糖环境诱导的LECs发生氧化应激反应是高糖引起的晶状体浑浊的原因之一[9]，晶状体细胞内大量产生自由基，同时抗氧化酶如SOD、GSH-PX、T-AOC等的含量降低，细胞内氧化代谢产物如MDA堆积导致细胞毒性损伤，造成细胞凋亡[10-11]。本研究用不同浓度的葡萄糖与HLEB-3细胞共培养，结果发现，随着葡萄糖浓度的增加，HLEB-3细胞MDA质量浓度随之增加，SOD、CAT、GSH-Px的活性随之下降，这一结果与预测结果一致，证实高糖环境能诱导LECs发生氧化应激反应。本研究将转染miR-211 inhibitor和miR-211 NC的HLEB-3细胞与葡萄糖共培养后，miR-211 inhibitor组细胞SOD、CAT、GSH-Px的活性高于miR-211 NC组，MDA质量浓度低于miR-211 NC组，说明miR-211能增加高糖环境下HLEB-3细胞的氧化应激损伤。

沉默信息调节蛋白1(silent information regulator, SIRT1)能通过组蛋白脱乙酰化作用调节下游叉头转录因子(forkhead box O, FOXOs)等转录因子的活性，减轻内皮细胞线粒体损伤，减缓内皮细胞氧化应激损伤[12-13]。有报道证实，SIRT1在糖尿病性白内障小鼠LECs中的表达的下调[13]；FoxO3a是FOX家族成员，在氧化应激环境中，SIRT1通过去乙酰化FoxO3a进而通过泛素化作用降解FoxO3a，抑制其诱导细胞死亡的能力，最终实现保护细胞免受氧化应激损伤[14]。有研究证实，高糖处理后，LECs中的FoxO3a蛋白表达以剂量和时间依赖性方式升高[15]，FoxO3a可以作为高血糖条件下人LECs氧化应激的生物标志物。本研究发现，随着氧化应激模型HLEB-3细胞中miR-211表达的增高，SIRT1的蛋白表达随之降低，同时，转染了miR-211 inhibitor的细胞中，SIRT1的表达高于转染miR-211 NC的细胞，而FoxO3a的表达低于转染miR-211 NC的细胞，提示SIRT1可能是miR-211 的一个靶基因，miR-211对高糖诱导下LECs氧化应激的调控作用可能是通过抑制SIRT1的表达而实现的。

综上所述，miR-211能降低高糖诱导下晶状体上皮细胞的抗氧化应激能力，这一过程可能是通过抑制SIRT1的表达而实现的。