血小板参数和血小板聚集功能检测对2型糖尿病治疗后监测的临床价值探讨*

赵 玲，杨伏猛，娄焕堃，刘婷婷，马 芳，梁 伟△

1.蚌埠医学院,安徽蚌埠 233000；2.蚌埠医学院附属连云港市第二人民医院检验科,江苏连云港 222000；3.江苏省连云港市东海县人民医院口腔科，江苏连云港 222300

随着人们生活水平的提高和人口老龄化的到来，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管疾病之后发病率居世界第3位的慢性病，严重威胁着人类的健康和生命。研究表明，90%以上的糖尿病患者主要死于心脑血管疾病并发症，而心脑血管疾病的发生、发展与血小板高活性状态密切相关[1]。研究表明，2型糖尿病(T2DM)患者的血小板处于高活性状态，因此，早期预防和治疗是阻止T2DM心脑血管疾病并发症发生、发展的关键[2]。本研究旨在探讨血小板参数、血小板聚集功能及血小板P-选择素和磷脂酰丝氨酸(PS)外翻检测对T2DM患者治疗后监测中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2020年4—9月于蚌埠医学院附属连云港市第二人民医院内分泌科进行住院治疗的非初诊T2DM患者60例纳入治疗组。选取同期蚌埠医学院附属连云港市第二人民医院内分泌科门诊确诊、初发、未经治疗的T2DM患者60例纳入初发组。选取同期排除T2DM的健康体检者60例纳入对照组。所有确诊患者均符合2016年美国糖尿病协会(ADA)制定的糖尿病诊断标准及分型标准。3组研究对象的年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。排除标准：(1)急性创伤或急慢性感染患者；(2)原发或其他继发性肾脏疾病患者；(3)急慢性心、肝、肺、肾、心脑血管、消化道疾病患者；(4)恶性肿瘤、自身免疫性疾病患者；(5)采集血液标本前2周未使用过抗血小板药物或抗凝药物。本研究经蚌埠医学院附属连云港市第二人民医院医学伦理委员会审批通过，符合2013年修订的《赫尔辛基宣言》的要求，研究对象均签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 血小板计数(PLT)、血小板压积(PCT)、血小板分布宽度(PDW)、血小板平均体积(MPV)的检测采用Sysmex XN-1000全自动血细胞分析仪及其配套试剂(日本希森美康公司生产)；分别应用二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和胶原(COL)作为血小板诱导剂，使用LBY-NJ4A血小板聚集仪(北京泰利康信公司生产)检测各组研究对象的血小板最大聚集率(PAgTm)，AA、ADP及COL所对应的试剂批号分别为20200427A、20200425B、20200424C，严格按照仪器标准化操作规程进行操作。流式细胞仪(美国BD公司)检测血小板P-选择素表达和PS外翻，试剂分别采用FITC标记的抗P-选择素单克隆抗体和APC标记的Annexin V。

表1 3组研究对象一般资料比较

1.3标本采集 (1)采集空腹静脉血2 mL，采用15%乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，进行血小板参数检测；(2)采集空腹静脉血3 mL，采用109mmol/L的枸橼酸钠以1∶9比例进行抗凝，采血完毕后及时混匀，避免使用溶血、脂血和乳糜血的标本，将采血管在160×g的离心力下离心10 min，分离富血小板血浆(PRP)；然后继续在2 000×g的离心力下离心10 min，分离乏血小板血浆(PPP)，PRP与PPP制备完成后分别以AA、ADP及COL作为诱导剂应用LBY-NJ4A血小板聚集仪来检测每例研究对象第300秒所对应的PAgTm。所有检测指标均要求4 h内完成。(3)制备洗涤血小板。取健康体检者或糖尿病患者静脉血与ACD(2.5%枸橼酸钠、2.0%葡萄糖、1.5%枸橼酸)按照1∶7比例抗凝，1 300 r/min离心20 min得到PRP，PRP经2 500 r/min离心20 min，沉淀用CGS缓冲液悬浮，经离心、洗涤，最后用MTB液重悬，得到洗涤血小板，调整血小板计数为3×108/mL，室温静置1～2 h使其恢复至静息状态以备用。

1.4检测方法 (1)PLT、PCT、PDW、MPV采用电阻抗法在全自动血液分析仪上检测；PAgTm采用光电比浊法检测。所有标本检测前，仪器均经过维护和校准，且室内质控符合要求方可实施检测。(2)流式细胞仪检测PS外翻：3 ×108/mL洗涤血小板50 μL加入250 μL 1 × Annexin V结合缓冲液和10 μL FITC标记的Annexin V，在避光、震荡条件下室温孵育20 min后，采用流式细胞仪进行检测，并记录Annexin V阳性细胞百分比。(3)流式细胞仪检测血小板P-选择素表达：3× 108/mL洗涤血小板50 μL加0.25 μL FITC标记的抗P-选择素单克隆抗体，室温孵育30 min，采用流式细胞仪检测。

2 结 果

2.13组间血小板参数及PAgTm比较 治疗组MPV明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，而PCT、PDW、PLT、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm在两组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；初发组MPV、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm明显高于对照组和治疗组，差异有统计学意义(P<0.001)；而PCT、PDW、PLT在3组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.23组间血小板P-选择素表达和PS外翻比较 对照组与治疗组PS外翻和血小板P-选择素表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而初发组与其他两组间的PS外翻和血小板P-选择素表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3各项指标对T2DM的辅助诊断价值 绘制MPV、AA-PAgTm、ADP-PAgTm、COL-PAgTm、血小板P-选择素及PS外翻辅助诊断T2DM的ROC曲线，且分别计算各项指标的ROC曲线下面积、cut-off值、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值，见表3。

表2 3组间血小板参数及PAgTm等指标比较

组别nAA-PAgTm(max,%)ADP-PAgTm(max,%)COL-PAgTm(max,%)血小板P-选择素(%)PS外翻(%)对照组6063.58±8.2765.27±8.5765.87±9.448.32±1.988.68±2.02治疗组6064.07±7.4165.95±8.0067.78±8.158.45±0.929.28±0.82初发组6075.87±4.01*#75.58±5.30*#76.93±6.43*#10.88±1.02*#11.38±1.56*#F62.4736.1831.9863.9352.61P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

表3 各项指标对T2DM的辅助诊断性能比较

3 讨 论

血小板主要来源于骨髓成熟的巨核细胞，PLT及MPV反映了骨髓中巨核细胞的增生、代谢及血小板生成情况[3]。有文献报道，MPV与血小板活性呈正相关[4]，可能是因为新生成的血小板体积较大，含较多致密体，能够释出多种内容物，故具有更高的功能活性。范志佳等[5]也综述了糖尿病患者的大截面血小板是细胞器丰富的大体积血小板，是糖尿病患者血小板高功能活性的主要原因。本研究发现，治疗组与初发组患者的MPV均明显高于对照组，这与已有的大量研究结果一致[3-4]。本研究发现，治疗组的PLT与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，本研究结果与李金密等[6]的研究结论一致。但也有研究发现，T2DM患者的PLT较健康对照者明显升高[7]。此外，也有学者发现，T2DM患者PLT较健康对照者明显下降[8]。截至目前，关于糖尿病是否会引起PLT的变化及如何变化，尚存在争议。

本研究结果显示，各组间PCT无明显差异，这与赵志勇等[4]的研究结果一致。也有研究者认为PCT在糖尿病患者中明显升高，且随糖尿病严重程度增加而升高[9]。

有研究发现，糖尿病患者的PDW较健康对照者明显升高[10-11]，可能与MPV升高引起PDW升高有关。但本研究发现，治疗组与对照组PDW并无明显差异，分析其原因，这都是单中心的研究结论，需要进一步扩大样本量实施多中心研究来确认PDW与T2DM的相关性。

有研究发现，MPV较大的血小板对诱导剂的聚集反应性也相应增强，更易促进血栓形成，使糖尿病患者发生微血管病变的危险性增加[12]。本研究发现，治疗组的PAgTm明显低于初发组，表明糖尿病患者经过规范化治疗后，可引起血小板聚集功能的下降，而血小板高聚集功能与糖尿病患者心脑血管并发症密切相关[13]。

此外，本研究发现，初发组血小板P-选择素和PS外翻的水平高于治疗组和对照组，而治疗组和对照组之间差异并不明显，说明未经治疗的T2DM患者体内血小板的活化和凋亡增加，此结果表明血小板P-选择素和PS外翻可作为初发糖尿病患者的辅助诊断指标之一，提示早期规范化降糖治疗可降低糖尿病患者血小板的聚集活性。因此，及早对糖尿病患者进行规范化治疗对延缓心脑血管疾病的发生、发展十分重要，目前临床对糖尿病患者心脑血管并发症的监测手段匮乏，本研究发现MPV、PAgTm、血小板P选择素和PS外翻可以作为T2DM患者是否被规范治疗的实验室评估指标，其中，血小板P-选择素用来辅助诊断T2DM的灵敏度最高(88.3%)，COL-PAgTm的特异度最佳(91.7%)，而AA-PagTm的诊断效率最优。

综上所述，本研究发现MPV、PAgTm、血小板P-选择素和PS外翻在初发未经治疗的T2DM中明显升高，经规范治疗后可明显降低血小板的活化水平，这些实验室指标可以辅助T2DM的诊治，为糖尿病患者心脑血管并发症的防控提供实验室数据支撑，值得在临床上推广。