Sebia Capillarys 3 TERA血清蛋白电泳的方法验证和流程优化*

沈若坚，吴 群，郭奕超，邵文琦△，王蓓丽,2，郭 玮,2

1.复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；2.复旦大学附属中山医院厦门医院检验科,福建厦门 361015

血清蛋白电泳能分离血清或体液中的不同分析物，有助于识别疾病过程相关的生物流体组分[1]。血清含有各种蛋白质，其等电点均在pH值7.5以下，若置于pH值8.0以上的缓冲液电泳时均游离成负离子，再向正极移动。由于其等电点、相对分子质量和分子形状各不相同，其电泳速度就不同，故可将血清中蛋白质进行区分[2]。血清蛋白电泳通常用于检测异常增生的单克隆免疫球蛋白(M蛋白，也称为M-带)以诊断和监测骨髓瘤[3-5]，但还有其他一些用途往往被忽略[6]。血清蛋白电泳对于肝病、严重感染性疾病及慢性肾脏病等的诊断、鉴别诊断、病情发展的判断有重要的意义[7]。发生肝炎时，γ带所占比例明显增加，肝硬化时出现“β-γ桥”现象；肾病综合征时α2区带所占比例明显增加[8]。国外有许多学者对血清蛋白电泳进行研究，有研究对第1代自动化毛细管电泳仪进行评估，发现其灵敏度、重复性都优于琼脂糖凝胶电泳，易于操作，适用于日常工作量较大的临床实验室，但由于检测M蛋白的特异度较低，可能会导致免疫固定分析的成本增加[9]。21世纪，Helena V8与Sebia Capillarys 2 Flex Piercing (C2)被广泛应用于各家实验室[10]。第2代电泳仪检测速度较快，灵敏度较高(可检测>0.3 g/dL M蛋白)，但特异度低于琼脂糖凝胶电泳，检测总蛋白水平低或低球蛋白血症患者的标本常出现假阳性。本研究对Sebia新一代毛细管电泳仪Sebia Capillarys 3 TERA(C3)进行了血清蛋白电泳的性能验证。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 检测仪器采用法国Sebia公司的Capillarys 3 TERA，试剂采用Sebia CAPI 3s Protein(E)6，试剂批号为PN2503，试剂盒包含700 mL缓冲液3瓶，滤器4个。

1.2检测性能评价

1.2.1精密度验证 根据国家食品药品监督管理局(SFDA)有关毛细管电泳仪医疗器械注册产品标准，用同一批号试剂对Sebia公司提供的正常水平范围内定值血清蛋白质控品(LOT:27047/01)重复检测24次，计算批内标准差(s)及变异系数(CV)；对任选的一个批号(LOT:27047/01)质控品连续测试20 d，每天检测1批次，检测12根毛细管的批间s及CV。

1.2.2正确度验证 选用国家卫生健康委员会临床检验中心2020年血清蛋白电泳室间质量评价样品(标本编号202011、202012、202013、202014、202015)，每个水平样品至少每天重复测定2次，连续测定5 d，记录检测结果，计算全部检测结果均值，判断各项指标均在给定的范围内。

1.2.3灵敏度验证 选择M蛋白水平500 mg/dL的血清标本，采用生理盐水按梯度倍比稀释，直到血清标本中的M蛋白峰不可分辨为止，记录各梯度对应的稀释倍数和血清标本水平，判断M蛋白峰不可分辨前，最大稀释倍数对应的血清标本水平是否小于或等于27 mg/dL。

1.2.4参考区间验证 选取随机体检标本24份进行血清蛋白电泳，剔除离群值，判断是否均在预设参考区间之内。

1.2.5线性范围验证 根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)EP6-A操作指南，使用溶液(A)清蛋白(Alb)溶液(52.0 g/L)和溶液(B)γ球蛋白溶液(31.0 g/L)，按不同比例混合(100% A溶液+0% B溶液，90% A溶液+10% B溶液等......0% A溶液+100% B溶液)得到共11份不同水平的Alb和γ球蛋白混合物，每份混合物检测Alb百分比3次，取均值，判断理论值与实测值的线性。

1.2.6交叉污染验证 将样品与蒸馏水共24份标本交替安放在试管架上，计算平均值、最大误差及相对误差，若最大相对误差≤ 5.2%，则交叉污染验证通过。

1.2.7仪器性能评价 计算实验室电泳岗位每日检测标本量、花费人力数量、毛细管电泳仪数量、转移标本的时间及频次，评估优化血清蛋白电泳检测流程。同时检测80份标本，比较C3与C2的检测速率与检测时间。

由于C2每份标本需要人力推送(1 s)，而本实验室有4台毛细管电泳仪，从第1台走到第2台用时1 s，到第3台用时1.5 s，到第4台用时2 s。每天需要检测3 000份标本，共计375架。每台仪器满负荷8架。每30分钟共检测约160份标本。

由于新仪器没有上述问题。去除标本插在架子上的时间，最后测算C3比C2节约多少时间。

2 结 果

2.1精密度验证 C3进行血清蛋白电泳的批内CV：Alb区带<2%，α1球蛋白(α1)、α2球蛋白(α2)、β1球蛋白(β1)、β2球蛋白(β2)、γ球蛋白(γ)区带<10%；批间CV：Alb区带<2%，α1、α2、β1、β2、γ区带<10%，均小于厂家提供的CV。见表1。

2.2正确度验证 正确度验证结果见表2，各项指标均符合要求，正确度验证合格。

2.3灵敏度验证 血清蛋白电泳可见M蛋白尖峰的最大稀释倍数为16倍，相应标本水平为16 mg/dL，最终患者标本水平≤27 mg/dL且仍能明显观察到单克隆迹象，符合要求。

2.4参考区间验证 24份体检标本，剔除离群值后，检测标本均在预设参考区间之内，符合参考区间验证要求。

表1 C3血清蛋白电泳的重复性、中间精密度验证结果

表2 正确度验证结果(%)

标本编号β均值靶值允许范围γ均值靶值允许范围2020119.08.86.2～11.411.611.58.6～14.420201210.510.37.2～13.412.712.89.6～16.02020139.58.86.2～11.411.011.38.5～14.12020148.88.66.0～11.211.610.88.1～13.520201513.012.78.9～16.511.011.88.9～14.8

2.5线性范围验证 从混合物中得到的每个区带百分比与理论上每个区带百分比完全符合，且使用CAPI 3 PROTEIN6程序可以根据线性检测到任何变化，相关系数(r)=0.999 0，斜率为0.999 9，截距为-0.317 9。见表3。

表3 线性范围验证结果(%)

续表3 线性范围验证结果(%)

2.6交叉污染验证 样品结果最大相对误差≤5.2%，无交叉污染，见表4。

表4 交叉污染验证试验结果(%)

2.7仪器性能评价 检测流程变化结果见表5。C3的检测速率约为每台72份/h，C2的检测速率约为每台64份/h；同时检测80份血清标本，C3 TERA用时58 min 57 s，C2用时59 min 45 s；前7架血清标本检测速率：C2>C3，前10架血清标本检测速率：C2

表5 C3与C2检测效率比较

表6 C3与C2血清蛋白电泳检测时间比较

3 讨 论

毛细管电泳是一种非常适用于临床分离蛋白质的技术。与临床常用的色谱方法相比，主要优点是分离效率更高，所需的样品体积更小。毛细管电泳的临床应用广泛，LATOSINSKA等[11]在研究毛细管电泳时发现，其与质谱技术联合检测对于泌尿系统疾病的诊断具有较高的灵敏度。多篇文献报道，血清蛋白电泳的使用有助于常见疾病的筛查[12-13]。因此，由于检测灵敏度较高，毛细管电泳仪在国内外实验室的日常检测中变得更加重要。

目前，CLSI没有明确应用于毛细管血清蛋白电泳的性能验证方案，国内外也鲜有对于毛细管血清蛋白电泳的性能评价。刘素兰等[14]曾对Sebia电泳仪及其配套试剂测定血清蛋白进行方法学评价，发现用毛细管电泳仪进行血清蛋白电泳操作简便、图谱清晰、分辨率高、重复性好、结果准确。本研究对C3血清蛋白电泳进行性能评价，结果显示，C3检测血清蛋白电泳具有良好的精密度、正确度、灵敏度、参考区间、线性范围，无交叉污染，检测性能符合临床要求，对于异常增生的M蛋白的检测灵敏度更高，最低检测水平< 27 mg/dL。

与C2相比，C3的检测优势主要体现在大批量血清标本的检测速度更快(每批次检测12份血清标本，每台1 h可检测约72份血清标本)，检测自动化程度更高，检测结果更准确。由于C2每份标本需要人力推送(1 s)，而本实验室有4台毛细管电泳仪，从第1台走到第2台用时1 s，到第3台用时1.5 s，到第4台用时2 s，而C3具备灵活组合的联机与自动进样装置，一台进样器可配备多台电泳仪器，因此仅需将标本放置于进样装置上即可，有效降低了人力成本。由于C3检测大批量标本时检测速度较快，可减少相应检测人力与标本转运频次，检测人员可在相同时间内检测更多标本。除此以外，与旧系统相比，C3软件的更新使操作人员一次性能浏览更多标本，C3检测系统更高的灵敏度及特异度使分析假阳性率降低，分析疑难标本更准确。C3故障发生率低于C2。对于每日需要检测大批量标本的实验室，C3能发挥最大的优势，功能方面优化了开机、关机、维护保养等功能，可以设定自动开关机，自动定时保养等功能。

本研究不同于以往毛细管血清蛋白电泳性能评价的一点是全部性能验证项目的检测都针对同一根毛细管，因此实验结果更可靠。但本研究由于未引入多台C3电泳仪，只能对一台单机配一台进样器的电泳流水线进行检测速度的评价，后续会在此基础上对两联机配一台进样器、三联机配一台进样器的电泳流水线进行性能评估。