某生物医药废水中乙腈降解菌的筛选与特性研究

邴 斌，韩 杨

（青岛市市政工程设计研究院有限责任公司，山东青岛 266100）

随着各种工业包括人造纤维、石油化工和金矿等工业的不断发展，含有有机腈类化合物的废水也越来越多，如果不加以采取措施进行处理直接排放，将会对人类的健康以及生存环境造成很大的影响[1]。降解腈类微生物产生的腈水解酶是一种非常重要的工业用酶，可以在温和的条件下将氰基水解成无毒的羧基和氨，由于腈水解酶具有高的化学选择性、区域选择性和立体选择性而备受人们的关注[2-3]。腈水解酶最早是由Thiman 和Mahadevan在1964 年从大麦叶中分离出来的[4]。许多研究者利用特定的腈类物质作为唯一碳源或者唯一氮源筛选到一系列可以产腈水解酶的微生物（包括细菌和真菌）以及植物。本研究针对目前工业生产带来的环境污染问题，从生物降解角度出发，从污泥中分离筛选可以降解乙腈的降解菌株，并对其生物特性进行了研究，为该类废水处理的工程设计提供依据。

1 实验材料和方法

1.1 样品的来源

选择山东某制药厂乙腈洗料车间下水道污泥中进行样品的采集，取10个取样点的污泥，这里含有大量洗料残留的乙腈，利用富集培养的方法进行降解微生物的筛选。乙腈和乙酸分别购自百灵威公司，其他试剂都为分析纯。

1.2 高活性腈水解酶菌种快速筛选策略

初筛：将所采集的污泥（1g）加入10mL 0.85%生理盐水中，用振荡器振荡均匀，静置25～30min。然后取2mL上清至250mL装有50mL富集培养基（以乙腈作为唯一氮源）的摇瓶中进行第一次富集，30℃，150r/min培养3d，接着将第一次富集的培养液取3mL至第二批富集培养液中进行第二次富集，3d后进行第三次富集。经过三轮富集培养后对培养液进行梯度稀释涂布平板，30℃培养2～3d。挑取单菌落于含有200μL以乙腈为唯一氮源的发酵培养基的96孔板中，30℃， 150r/min，培养2d后，加入pH指示剂溴甲酚紫进行显色，将显黄色的菌从平板上挑取进行第二次复筛。

复筛：将初筛显示黄色的菌种转接到50mL发酵培养基，30℃，150r/min下，培养36～48h后，将发酵液离心9 000r/min，10min，将离心的菌体用生理盐水洗涤三次，均匀悬浮于蒸馏水中制成一定浓度的菌悬液。取10mL菌悬液加入0.1g乙腈，降解一定的时间后，取样进行气相液相检测分析。

1.3 最适降解条件的优化方法

在10mL反应体系条件下，选取1%乙腈作为底物，不同转化温度为：20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃，在30 ℃，150r/min条件下降解一定的时间。在最优温度附近，选择四个梯度35、45、55、65 ℃进行菌株的降解率稳定性研究。

用6mol/L HCl和NaOH将自来水调至pH范围为6.0～10.0不同梯度的水溶液作为反应体系，在30℃，150r/min条件下降解一定的时间，取出样品进行GC检测。为了考察不同pH的水溶液对菌株降解效率的稳定性，本实验选择了四个pH不同的梯度：5、5.5、6、6.5，将降解菌株放于不同pH的水溶液中，置于0℃，定期取出于含有1%乙腈水溶液中，30℃，150r/min降解一定的时间。

2 结果和讨论

2.1 温度对降解率的影响

由于微生物胞内存在可以降解氰类物质的酶类，然而酶在降解乙腈物质的过程中起着至关重要的作用，然而温度会影响酶的作用能力。如图1所示，降解过程中，温度为45℃时，降解率达到最高；温度低于45℃时，降解效率随着温度的升高呈上升趋势；温度高于45℃时，降解效率开始下降，因此在用降解菌株处理含有乙腈的污水时，需要考虑温度的因素，在此研究中，最适降解温度为45℃。

在工业处理废水中，考虑降解菌株的降解氰类化合物的持久性，温度稳定在最适温度条件下是否稳定，成为被常 研究的因素，因此，本研究在最适温度45℃附近，选择了35、45、55和65 ℃四个梯度进行了研究，最长处理时间达16h，从图2A可以看出，降解菌在35℃较为稳定；

图1 温度对降解率的影响

根据公式（1），得到图2B的拟合斜率，可以计算得知：降解菌株在35、45、55和65 ℃条件下的Kd分别为：0.052 49、0.263 21、0.75633和1.524 27，接着根据公式（2），计算出4个温度下所对应的半衰期（降解菌株的降解率下降至50%所需要的时间）分别为13.2、2.63、0.91和0.45h。

图2 不同温度下降解率的稳定性（A）和拟合曲线（B）

2.2 污水 pH 对降解菌降解率的影响

在进行污水氰基化合物的降解过程中，污水不同的pH对降解菌株的降解率会产生一定的影响。本实验将污水的pH调至6.0～10.0，对其降解率进行了考察，如图3所示，在不同pH条件下，降解菌株的降解率是不同的，当pH为7.0时，降解率较高，可以达到100%；当pH低于7.0时，随着pH的降低，降解率呈剧降趋势；当pH高于7.0时，降解率仍然会处于下降趋势，因此污水的pH需要调节在6.0～7.0。

图3 不同 pH 的污水对降解率的影响

在考察了pH对降解率的影响前提下，进一步考察了降解菌在最适pH范围内的稳定性，本实验采取了四个不同的pH来考察了降解菌pH的稳定性，这4个pH分别为5、5.5、6.5、7。如图4所示，pH在6.5时的降解率也是最稳定的，基本与最适pH条件结果是吻合的。从整体的变化趋势来看，该降解菌在微酸条件下还是较稳定的。

图4 不同 pH 下降解率的稳定性

2.3 降解菌对乙腈的耐受研究

氰基化合物在较高的浓度下对降解菌是有一定的毒害作用，因此为了研究降解菌株对乙腈的最大耐受能力，在10mL降解体系中，分别加入不同浓度的乙腈，一定量的湿菌体量，30℃，150r/min降解一定的时间后取样，进行降解率的分析。如图5所示，降解菌在小于4% 乙腈范围内，降解率随着浓度的升高而升高，但当乙腈的浓度超过4%，降解菌的降解率则处于下降趋势，从而了解到该降解菌可以耐受的乙腈浓度为4%。

图5 降解菌株对污水中乙腈的耐受性

3 结论

从山东某制药厂乙腈洗料车间的下水道的污泥中进行样品的采集，经过富集培养的方法，筛选分离到一株具有降解乙腈能力的菌株，对该菌株降解乙腈的条件包括温度、pH和乙腈耐受程度做了研究，该降解菌最适降解温度为45℃，且在35℃较为稳定，该降解菌在微酸条件下还是较稳定的，其耐受的乙腈浓度为4%，相关成果为该类废水处理工程的设计提供了依据。