十八味诃子利尿丸对雄性糖尿病肾病大鼠肾组织RAGE-NF-κB信号通路的影响※

郑良璐，王 刚，吴 穹

(1.青海大学，青海省糖脂代谢疾病防控中医药重点实验室，810000，青海 西宁；2.南方医科大学第五附属医院，510900，广东 广州)

研究表明，炎症反应与糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发生、发展密切相关[1]。因此，具有抗炎功效的十八味诃子利尿丸在临床上用于治疗DN，但其作用机制不明，本研究拟通过RAGE-NF-κB炎症信号通路探讨十八味诃子利尿丸对DN的影响。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级4周龄雄性Sprague Dawley( SD)大鼠30只，体质量80～100 g，购于西安交通大学医学部实验动物中心，许可证号【SCXK( 陕)2017-003】。每笼喂养2只，室温( 22±2)℃，相对湿度65%～75%，灯光设置为12小时的明暗循环(早上8点开灯)。予自由摄食(水)。在研究开始之前，所有动物的血糖正常，尿液蛋白为阴性。动物饲养于青海大学医学院实验动物房(SYXK(青)2016-0001)。本研究经青海大学伦理委员会批准。

1.1.2 主要药物与试剂

十八味诃子利尿丸(青海省格拉丹东药业有限公司，批号为2008107)；STZ( Sigma公司)；柠檬酸钠无菌缓冲液(Solarbio公司)；RAGE、IL-6、IL-1β兔克隆抗体(biossantibodies公司，批号分别为Bs-0177R、Bs-4539R、Bs-0812R)；NF-κB P65兔克隆抗体(affbiotech公司，批号为AF5006)；TNF-α兔克隆抗体(proteintech公司，批号为17590-1-ap)；β-actin兔克隆抗体(abclonal公司，批号为AC026)；兔多克隆抗体NF-κB P65、RAGE、IL-6、IL-1β(北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为bs-0465R、bs-0177R、bs-4539R、bs-0812R)；兔多克隆抗体TNF-α(abcam公司，批号为ab6671)。

1.1.3 主要仪器

卓越金采血糖仪及试纸(Roche公司)；DW-86L386超低温冰箱(中国海尔集团)；H2050R高速低温离心机(中国湘仪集团)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(中威电子仪器有限公司)；BMJ-Ⅲ型包埋机(中威电子仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组及给药

大鼠适应性喂养72 h后选取20只喂以高糖高脂饲料(基础饲料上加10%蔗糖、10%猪油、1%胆固醇、0.3%胆酸钠)，喂养12 w后于尾静脉一次性注射STZ溶液[注射剂量：25mg/kg。将STZ溶于柠檬酸钠无菌缓冲液(0.1mmol/L)，配制成2%的STZ溶液]，在注射后第3、7 d测尾静脉血糖，以7 d随机血糖高于16.7 mmol/L视为糖尿病大鼠造模成功。继续用原饲料喂养大鼠5 w，收集24 h尿液，以24 h尿蛋白≥30 mg视为DN大鼠造模成功。其余10只作为对照组喂以普通饲料，喂养12 w后于尾静脉一次性注射等量的柠檬酸钠无菌缓冲液，继续用原饲料喂养5 w。将造模成功的大鼠分为模型组(n=9)、藏药组(n=9)。藏药组予十八味诃子利尿丸灌胃(丸药研细粉，过100目筛，用蒸馏水配置成混悬液，给药剂量0.3g/kg)。对照组和模型组均予等容量的生理盐水。连续灌胃2 w。

1.2.2 标本收集及指标测定

药物灌胃结束当天，大鼠禁食12 h后用1%戊巴比妥钠麻醉(300mg/kg)大鼠，处死大鼠后取双侧肾脏，经肾门冠状面切取组织用4%多聚甲醛固定用于HE染色；部分肾组织置-80 ℃冰箱保存用于WB检测；取若干约1 mm3体积大小的肾组织置4%多聚甲醛液中固定，用于免疫组化检测。

1.2.3 切片制作

切片：组织经4%多聚甲醛固定后，经乙醇梯度脱水、包埋、切片、染色、封片而成，可在光学显微镜下放大400倍观察。

1.2.4 Western blot检测

取大鼠肾组织，裂解，离心后取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。经蛋白变性、上样、电泳、转模、封闭、孵育(抗体)、显影、定影，计算目的蛋白相对表达量。

1.2.5 免疫组化染色

以常规方法做免疫组化染色。

1.2.6 统计学处理

2.结果

2.1 肾脏病理结构

对照组肾小球未见毛细血管基底膜或基质增生，无变性、坏死及纤维化；肾小管结构较为完整，间质内无充血及炎细胞浸润；髓质集合管结构完整清晰，未见变性、坏死和脱落。模型组肾小球萎缩，肾小管上皮细胞变性坏死，肾小管呈蛋白管型，间质炎性细胞浸润。藏药组肾组织病理损伤有不同程度的改善。详细情形见图1。

对照组 模型组 藏药组

2.2 大鼠肾组织炎症因子蛋白水平

与对照组比，模型组RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达明显升高(P<0.05)，与模型组比较，藏药组RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达明显降低(P<0.05)，详细数据见表1。黄色或棕黄色为阳性表达。对照组RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β在肾小管细胞胞浆内仅见少量表达，与对照组比，模型组黄色或棕黄色区域增加，颜色深度明显增强，与模型组比，藏药组黄色或棕黄色表达区域减少，颜色深度变浅，详细情形见图2。

表1 各组大鼠肾组织RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达量

2.3 炎性因子水平

与对照组比，模型组大鼠肾组织NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达均明显升高(P<0.05)；与模型组比，藏药组大鼠肾组织NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达均明显降低(P<0.05)，详细数据见表2，详细情形见图3。

图2 各组大鼠肾组织RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达图

表2 Western blotting检测各组大鼠肾组织RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达量的变化结果

图3 十八味诃子利尿丸对雄性DN大鼠肾组织RAGE、NF-κB P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达的影响图

3.讨论

本实验采用高糖高脂饮食加STZ尾静脉注射制备DN大鼠模型。模型大鼠肾小球萎缩，肾小管上皮细胞变性坏死，肾小管呈蛋白管型，间质炎性细胞浸润，显示DN大鼠造模成功。经十八味诃子利尿丸治疗后，肾脏病理损伤明显好转，提示十八味诃子利尿丸对DN大鼠肾组织有保护作用。

越来越多的研究证明炎症反应在DN发病中起重要作用。RAGE是细胞表面分子免疫球蛋白超家族的一种模式识别受体[2]，该受体由一个胞外区域(一个V型和两个C型免疫球蛋白结构域)、一个疏水跨膜结构域和一个短的细胞质尾部组成[3]。细胞外区域可以结合多种配体，长期高糖刺激致RAGE表达增强[4]，与配体(如晚期糖基化终产物AGEs)相互作用激活细胞内信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NADPH氧化酶和转录因子NF-κB通路[5]，其中NF-κB的激活在DN的肾脏炎症进程中起关键作用[6]。NF-κB是一种普遍存在的核转录因子，包括5个亚单位(Rel、p65、RelB、p50、p52)，其中属NF-κB通路蛋白家族重要组成之一的p65蛋白，能加速炎症因子的表达[7]，一旦NF-κB被激活，就会进一步激活其下游促炎因子如RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，导致DN的恶化[8]。动物实验研究表明，在DN小鼠模型中，RAGE基因失活可明显抑制DN早期和晚期的肾脏功能及结构改变，包括蛋白尿和血清肌酐增加及肾脏增大、系膜扩张、肾小球细胞数量增加、晚期肾小球硬化，且肾脏损伤程度与RAGE基因剂量成正比[9]。研究表明TNF-α可能通过改变肾小球的细胞结构，改变具有血管收缩和血管舒张作用的物质之间的平衡，从而导致肾血流减少和血管通透性增加[10]，IL-6与内皮细胞通透性的改变、系膜细胞增殖的诱导以及纤维连接蛋白表达的增加有关[11]。尿白蛋白排泄率与肾脏IL-6、TNF-α表达增加显著相关[12]。IL-1β能激活固有系膜细胞释放生长因子增加细胞外基质的产生，促进肾脏损害[13]。产生的RAGE、TNF-α反过来继续刺激NF-κB，形成恶性循环[14]，从而加重DN炎症进展。本研究结果显示，模型组NF-κB P65、RAGE、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达明显上调，经十八味诃子利尿丸干预后表达下降，提示十八味诃子利尿丸可通过抑制RAGE-NF-κB炎症信号通路减轻肾脏损伤。

综上所述，十八味诃子利尿丸可以改善DN大鼠肾脏组织病理损伤，减轻肾脏炎症损伤，其机制可能与抑制RAGE-NF-κB炎症通路有关。