20种中药对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用研究*

张月佳 梁思欣 张嘉嘉 陈 鑫 翁闪凡

佛山科学技术学院口腔医学院，广东省佛山市 528000

痤疮丙酸杆菌(Propionium acnes)是引起痤疮的主要菌群，痤疮丙酸杆菌的是一种革兰氏阳性厌氧杆菌，能联同人类皮脂腺细胞分泌皮脂，痤疮丙酸杆菌的过度增殖能使皮脂腺细胞分泌旺盛，引起皮脂腺角化、固有免疫等反应，最终导致炎症作用[1-2]。痤疮是一种常见的慢性皮肤疾病，多见于青少年。经研究导致痤疮发生的常见因素主要有4种：内分泌失调、炎症和免疫反应、皮脂腺的异常角化并形成角栓、丙酸痤疮杆菌的过度增殖[3]。近年来治疗痤疮的方法有物理治疗、药物治疗，药物治疗主要是通过抑制痤疮丙酸杆菌的生长达到治疗痤疮的目的[4-5]。目前常用的药物有四环素、罗红霉素等抗生素，但随着耐药菌的出现，这些抗生素的疗效开始下降。我国运用中医中药治疗痤疮已久且疗效显著，中药治疗痤疮的机制有抑制毛囊皮脂腺微生物生长、抑制皮脂分泌、抗炎免疫等[6]。同时中药多具有天然活性，成分复杂，副作用小，不易使致病菌产生耐药性，在抗菌研究领域是一个新的研究方向[7]。为此本研究致力于寻找对痤疮丙酸杆菌抑制效果明显的中药。本实验通过对20种清热解毒的中药对痤疮丙酸杆菌的体外抑制来寻找最为有效的中药成分，为治疗痤疮提供新的配方。

1 材料与方法

1.1 中药及制备 中药黄连(Coptidis rhizoma)、黄芩(Radix scutellariae)、夏枯草(Selfheal)、半枝莲(Scutellariae barbatae)、金银花(Honeysuckle)、射干(Blackberry lily)、蒲公英(Herba taraxaci)、白花蛇舌草(Herba hedyotis)、板蓝根(Isatis root)、鱼腥草(Cordate houttuynia)、决明子(Semen cassiae torae)、知母(Rhizoma anemarrhenae)、栀子(Fructus gardeniae)、大叶青(Big leaf Green)、赤芍(Paeonia veitchii lynch)、牡丹皮(Bark of tree peony root)、芦根(Rhizoma phragmitis)、菊花(Chrysanthemum)、生地黄(Dried rehamnnia root)、石膏(Gypsum)均购买于佛山市第一人民医院药剂科，上述20味中药各取30g,分别用500ml蒸馏水浸泡约1h后，在砂锅中文火煎煮2h，用无菌纱布趁热过滤煎液，再加入300ml蒸馏水于滤渣中，用同样的方法煎煮2h，将两次过滤后的煎液合并至烧杯中，加热浓缩到30ml，即可得到浓度约为1g/ml的中药原液，将制备好的药液装入瓶中加盖，于高压蒸汽灭菌锅中高压灭菌(121℃，15min)待冷却后保存于4℃冰箱备用。

1.2 菌株与试剂 痤疮丙酸杆菌菌株冻干粉(ATCC11827购自广东省微生物菌种保藏中心)，硫乙醇酸盐培养基、琼脂粉、厌氧袋及产气包均购自青岛海博生物。

1.3 细菌复苏及菌悬液制备 取痤疮丙酸杆菌菌株冻干粉，在酒精灯下敲断安瓿，加0.5ml生理盐水混匀，接种在平板上，于厌氧环境中37℃下培养48～72h。菌悬液制备，取新鲜培养的痤疮丙酸杆菌固体平板，在平板上刮取若干单个菌落用液体培养基稀释至约0.5麦氏单位(约为1×108CFU/ml)，在此基础上，再稀释10倍(约107CFU/ml)，待用。

1.4 中药对痤疮丙酸杆菌抑菌作用初筛实验 采用牛津杯法：取1.3中制备好的新鲜菌悬液300μl，用涂布棒均匀涂在固体培养基上，待干燥后用镊子取无菌的牛津杯(直径8mm)轻放在培养皿表面，轻压使其接触良好(一个100mm平板同时可放置4个牛津杯，同时测定4种中药的活性)，将制备好的中药药液200μl放入牛津杯中，用封口膜封好培养皿放入厌氧袋置于37℃恒温培养箱培养48～72h。观察结果，测量抑菌圈，该实验独立重复3次。结果判定标准：抑菌圈直径>20mm为高敏，抑菌圈直径10～20mm为中敏,抑菌圈直径<10mm为耐药。

1.5 初筛后中药对痤疮丙酸杆菌最小抑菌浓度MIC测定 采用96孔板微量肉汤稀释法：取96孔板，分别在每排的第一个孔加入已稀释200mg/ml初筛后的中药药液200μl，第2～12孔每孔依次加入100μl硫乙醇酸盐流体培养基，用排枪从第1孔中取100μl中药药液至第2列孔，混匀，依此类推进行倍比稀释至第10孔，弃去100μl，第1～11孔分别加入0.5麦氏单位稀释1 000倍的痤疮丙酸杆菌菌液100μl，12孔入补充100μl硫乙醇酸盐流体培养基，第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照，将96孔板放入培养箱37℃培养48～72h，最后观察读取并记录MIC。

2 结果

2.1 中药抑菌作用初筛结果 20种中药经过牛津杯法初筛发现，知母、黄芩、半枝莲、夏枯草4种中药有明显体外抑制痤疮丙酸杆菌的活性，其中知母根据3次抑菌圈结果(24.0±1.0)mm，为高度敏感，黄芩、半枝莲和夏枯草为中度敏感，抑菌效果从大到小依次为黄芩(18.4±2.0)mm、夏枯草(16.5±1.5)mm、半枝莲(10.5±0.5)mm。而其他16种中药对菌株均在牛津杯周围未形成明显抑菌圈，故对痤疮丙酸杆菌明显无体外抗菌活性。见表1(3次独立实验结果取平均值)。

表1 20种中药体外抑菌结果初筛

2.2 4种中药最小抑菌浓度(MIC)测定结果 用微量肉汤稀释法检测知母、黄芩、半枝莲、夏枯草4种初筛有效果中药的MIC，结果发现抑菌浓度分别为0.195mg/ml、6.250mg/ml、3.125mg/ml、6.250mg/ml。知母对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用最为显著，为0.195mg/ml,黄芩、半枝莲、夏枯草的作用效果相似，MIC在3～7mg/ml之间。MIC检测结果与牛津杯结果整体上一致，均是知母效果最为显著，提示知母具有显著的体外抑制痤疮丙酸杆菌活性，并且明显优于其他清热解毒的中药。

3 讨论

痤疮是一种常见的慢性皮肤疾病，由多因素综合作用所导致，多见于青少年，但中年也可见。痤疮可能会导致炎症后色素沉着和瘀斑，甚至会对人的生理心理产生影响，严重者会导致毁容。痤疮丙酸杆菌是一种革兰氏阳性厌氧杆菌，是皮肤正常寄生菌，但同时也是条件致病菌。其作为一种非炎性致炎因素，能使皮脂分泌旺盛，能分解三酰甘油为自身繁殖提供条件，还能激活单核细胞，从而释放炎症因子引起炎症。同时，还是引起痤疮的关键环节，一般寄生于人体皮肤毛囊皮脂腺漏斗部，是皮肤的常驻菌群之一。有研究表明痤疮丙酸杆菌的细胞壁等破碎物能使皮脂分泌增加，使得毛囊皮脂腺导管发生堵塞，形成有利于痤疮丙酸杆菌繁殖的厌氧环境，最终导致皮肤菌群失衡，导致痤疮发生。中药以其浓厚的中国文化背景及其独特疗效，日益受到众人的关注[8]。中医认为，痤疮的发病多于湿、热、痰、毒有关，临床主要分为肺经风热、脾胃湿热、肝气郁结等症状。中药治疗痤疮主要用清热解毒、凉血泻火及活血化瘀的方剂熬成汤药应用于内服或制成膏剂外涂[9]。随着大家不断对中药的深入了解，中药不断被用于科学研究。其中中国传统中药资源丰富，毒副作用小，能产生多方面药理效应，具有抑制细菌生长的功效且不易产生耐药性的特点，已成为如今探索各种细菌抑菌物质的方向[10-11]。

本研究从临床上选择了20种清热解毒的中药，进行痤疮丙酸杆菌的体外活性尝试。初步抑菌结果显示知母、黄芩、夏枯草、半枝莲等20种清热解毒中药里，知母、黄芩、夏枯草、半枝莲有明显抑制痤疮丙酸杆菌的作用，其中，知母抑制作用最为显著，在随后的MIC检测中，证实知母的MIC最小，为0.195mg/ml,进一步证实知母在体外有非常显著的抗痤疮丙酸杆菌作用。知母是百合科知母属植物，最早记载于《神农本草经》，味甘苦，性寒。已有研究报道，知母是抗菌活性广泛的中药，对葡萄球菌、伤寒杆菌有较强的体外抑制作用，对大肠杆菌、枯草杆菌等也有抑制作用[12-13]，但是对痤疮丙酸杆菌的研究甚少，主要因为该菌株生长要求比较苛刻。有研究表明某些中药可阻断痤疮丙酸杆菌某些组分的合成或抑制细菌外排泵，从而达到抑菌作用，这仅仅只是其作用的其中一种机制，主要机制还可能在于调节人体阴阳平衡，即调节机体环境，从而达到抑制痤疮丙酸杆菌生长的环境。总之，痤疮丙酸杆菌在影响痤疮各个核心环节起到重要作用，中药对该菌株在体外有很好的抑菌活性，可为痤疮的临床治疗提供新的思路，同时也有利于中药文化的推广。