MCL1激活MAPK-MEK信号通路促进食管癌细胞EC9706增殖

崔艳丽 何利珍

河南省焦作市第二人民医院检验科 454000

食管癌是一种常发的严重肿瘤，引起食管癌的因素较多，以不良饮食习惯、经济社会地位和常吃粗粮等相关性比较高[1]。临床上治疗食管癌多以手术、放化疗为主，且发生率和死亡率在国内均较高。为了提高癌症患者的生存率和存活时间，逐渐开始尝试一些分子靶向疗法，但在食管癌中还没有成熟的分子靶点，需要进一步揭示调控食管癌增殖的分子机制，找到好的分子治疗靶点。

髓样细胞白血病因子1(Myeloid cell leukemia-1，MCL1)最初被发现是细胞分化相关的一个基因，在白细胞分化过程中被发现其能够诱导单核/巨噬细胞分化途径。后来发现MCL1是一种肿瘤发生相关的蛋白，在多种消化道肿瘤中高表达，但是其在食管癌中表达情况及是否影响食管癌细胞增殖还不确定。本项目基于对临床病例材料进行检测，发现MCL1在食管癌组织中高表达，并通过构建MCL1的真核表达载体，探讨其对食管癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 组织样品收集 食管癌样本为2018年在本院手术切除癌组织样本(男9例，女3例，平均年龄68.3岁)。对照样本为对应的癌周组织。将癌组织样品及癌周组织碾磨，以Triol法提取RNA，然后用实时相对定量法(qRT-PCR)检测食管癌组织中MCL1基因转录情况，所用定量引物序列为：Q-MCL1-F:5’-GAC GAG TTG TAC CGG CA GTC-3’,Q-MCL1-R:5’-TTT GTT ACG CCG TCG CTGA-3’。产物大小为266bp。内参引物序列为：Q-β-actin-F:5’-GAG AAA ATC TGG CAC CAC ACC-3’，Q-β-actin-R:5’-GGA TAG CAC AGC CTG GAT AG CAA-3’。产物大小为177bp。

1.2 细胞培养 食管癌细胞EC9706在37℃恒温二氧化碳培养箱中培养，培养液为添加10%胎牛血清和1%青链霉素的RPMI1640培养基。其中，RPMI1640基础培养基购自Hyclone公司，胎牛血清购自依科赛生物科技有限公司，青链霉素购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 载体构建 实验中用到的pCDNA3.1/myc-His载体购自Addgene公司，基因扩增自EC9706细胞。实验中所用的克隆引物为：MCL1-F: CGG GAT TCA TGT TTG GCC TCA AAA GAA ACG CGG，MCL1-R: GGA ATT CTC TTA TTA GAT ATG CCA AA CCA。产物大小为：1 068bp(含酶切位点及保护碱基)。引物由生工上海生物工程(上海)股份有限公司合成。构建的载体命名为：pCDNA3.1-MCL1-myc-His。

1.4 转染试验 EC9706细胞提前接种于12孔细胞培养板，次日细胞生长至80%铺满皿底时，实验组每孔转染pCDNA3.1-MCL1-myc-His质粒3μg，对照组转染pCDNA3.1/myc-His空质粒3μg。转染步骤按照Thermo Turbofect转染试剂说明书进行，在转染24h和48h后进行收样检测。

1.5 Western blot检测 上述1.4中细胞样品，弃去培养基，用添加蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液100μl在冰上裂解细胞15min，然后添加6×loading buffer, 蛋白样品95℃煮样10min后备用。聚丙烯酰胺凝胶电泳(100V，1.5h)分散蛋白后，将胶上蛋白转膜(250mA，100min)转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭2h后，以抗磷酸化MEK1(p-MEK1)抗体(1∶1 000，购自Abclone公司)、以抗MEK1抗体(1∶1 000，购自Abclone公司)、β-actin抗体(1∶5 000，购自Abclone)为一抗分别孵育PVDF膜4℃过夜；PBST溶液清洗PVDF膜3次后；以HRP标记的羊抗鼠/兔二抗(1∶5 000，购自Abclone公司)室温孵育1h；然后用PBST溶液清洗PVDF膜3次；ECL化学发光液(购自Millipore公司)显色，化学发光仪拍照。

1.6 细胞计数 将细胞接种至12孔板，待细胞生长至70%左右时转染MCL1真核表达载体和对照的空载体，分别在转染后0、24和48h，用胰酶消化细胞，以血球计数板计数，每组3个样品，每个样品重复计数3次。

1.7 细胞划痕试验 细胞生长至80%左右时转染超表达MCL1的质粒，并同期转染空质粒作为对照。在次日细胞长满皿底时，以无菌移液器吸头在细胞皿内划线，分别在划线后0、24和48h后拍照，检测细胞迁移能力变化情况。

1.8 细胞周期检测 上述1.4中细胞样品，以PBS清洗细胞后，胰酶消化后再次以PBS清洗细胞1遍，离心弃去PBS，以预冷的70%乙醇在4℃固定细胞48h，然后离心弃去乙醇，以PBS悬浮细胞，加入细胞周期用PI溶液，在37℃孵育30min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.9 qRT-PCR检测 上述1.4中细胞样品，弃去培养基并以PBS清洗1遍后，每孔加入1ml Trizol试剂(购自Takara公司)，提取细胞总RNA，然后以反转录试剂盒(购自天根生化科技有限公司)反转录获得cDNA，再以荧光定量试剂盒(天根生化科技北京有限公司)检测相关下游基因表达情况。Q-C-MYC-F:5’-CCG ACC AGC TGG AGA TGG TGA-3’，Q-C-MYC-R:5’-AGC CTG GTA GGA GGC CAG CTT-3’；Q-C-FOS-F:5’-CTA TGC AGC AGA CTG GG AGC-3’，Q-C-FOS-R:5’-AGA CGT GTA AGC AGT GC AGC-3’；Q-CCND1-F:5’-AGC TGT GCA TCT ACA CC GAC-3’，Q-CCND1-R:5’-GAA ATC GTG CGG GGT CA TTG-3’。

1.10 统计学方法 采用 Graphpad Prism5 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MCL1在食管癌组织中高表达 2018年1—12月在本院收集的12例手术切除的食管癌组织(Cancer tissue) 样品及其癌周组织(Control)样品，通过qRT-PCR检测，将对应的数据等比例换算后，发现在其中10份临床样品中，MCL1在食管癌组织中表达量高于对应的癌周组织，仅2例差异不显著，如图1所示。

图1 相对定量PCR检测12例癌组织(Cancer tissue)和癌周组织(Control)中MCL1表达量 两组比较，*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001

2.2 构建表达MCL1的真核表达载体 通过PCR的方法，用保真酶将MCL1基因扩增出来(图2A)；双酶切后装至pCDNA3.1/myc-His载体上，酶切验证构建的目的载体pCDNA3.1-MCL1-myc-His，结果显示获得和预期大小的条带(图2B)，测序后序列无突变。这些结果提示载体pCDNA3.1-MCL1-myc-His构建成功。

图2 核酸电泳结果

2.3 细胞计数检测超表达MCL1促进EC9706细胞增殖 将构建好的MCL1真核表达载体pCDNA3.1-MCL1-myc-His转染至EC9706细胞内，同时以转染pCDNA3.1/myc-His空质粒为对照组，在转染后24和48h分别检测两组的细胞数量，结果显示超表达MCL1组的细胞数量高于对照组，其中在转染48h，差异显著，如图3所示。

图3 细胞计数检测不同时间点细胞数量差异 两组比较，*P≤0.01

2.4 细胞周期检测超表达MCL1促进EC9706细胞增殖 以流式细胞仪检测细胞周期，结果显示，在转染24h后对照组(Control)和超表达MCL1组(MCL1)的G1期比例分别为(72.44±0.56)%、(70.05±1.05)%(P≤0.05)；在转染质粒48h后G1期细胞比例分别为(73.95±0.05)%、(71.55±0.55)%(P≤0.01)；对应的S+G2期细胞比例在超表达MCL1后高于超表达空质粒的对照组。以上结果提示超表达MCL1能够增加S+G2期细胞比例，提高了细胞增殖能力，如图4所示。

图4 流式检测超表达MCL1后细胞周期变化

2.5 超表达MCL1促进EC9706细胞迁移 细胞转染MCL1后，次日细胞将近铺满皿底，以移液器吸头划线，并将培养基换成无血清培养基，在划线后0、24和48h拍照。结果显示，超表达MCL1的细胞显示更好的迁徙能力，尤其在48h时差异较显著，如图5所示。

2.6 抑制MAPK信号通路能够抑制EC9706细胞增殖 用抑制剂U0126(100nM)处理细胞，Western blot检测MEK含量降低，磷酸化MEK含量增加(图6)；细胞计数检测发现用U0126抑制剂处理细胞24和48h后，细胞数量较仅加溶剂的对照组(Control)明显减少，如图7所示。以上结果显示抑制MAPK-MEK信号通路能够抑制EC9706细胞增殖。

2.7 超表达MCL1激活MEK信号通路 在细胞内转染pCDNA3.1-MCL1-myc-His来超表达MCL1蛋白，以转染空载体pCDNA3.1/myc-His的细胞为对照组(Control)，Western blot检测发现MCL1能够减少MEK含量，增加p-MEK含量(图8)；qRT-PCR检测MEK下游靶基因C-MYC、C-FOS和CCND1，结果显示，EC9706细胞中超表达MCL1后能够激活MEK下游靶基因的转录, 差异显著有统计学意义，如图9所示。

图5 细胞划痕实验检测超表达MCL1后对细胞迁移的影响

图6 Western blot 检测U0126处理细胞后细胞内MEK1含量变化

图7 细胞计数检测U0126处理细胞后细胞增殖情况 两组比较，*P≤0.05

图8 Western blot 检测超表达MCL1后细胞内MEK含量变化

3 讨论

MCL1能够和Bcl2互作，在抗细胞凋亡方面发挥作用，癌细胞通常由正常细胞转化产生，因此，抗凋亡和调控细胞分化的BCL1基因可能和癌细胞的生成存在相关性。除了在骨髓瘤中检测其和癌症的预后相关外，在前列腺癌[2]、胃癌[3]等均和癌症的发生存在相关性。但是，MCL1是否可以作为食管癌的标记基因，在食管癌中的表达规律还不清楚。本研究通过对近期临床上收集的12份食管癌组织样品进行检测，发现大部分癌组织中均高表达MCL1基因。因此，笔者推测在食管癌发生中，MCL1也可能发挥重要作用。

图9 相对定量PCR检测超表达MCL1后EC9706细胞内 C-MYC、C-FOS和CCND1基因表达量变化 两组比较，*P≤0.05；**P≤0.01

癌细胞和正常细胞的一个差异是癌细胞能够持续增殖，前期研究表明，MCL1是维持T细胞存活重要的基因[4]。在前列腺癌细胞中，MCL1是一个治疗靶点，抑制MCL1的表达能够诱导前列腺癌细胞增殖[5]。这些结果表明MCL1在调控癌细胞增殖时发挥重要作用，为检测在食管癌中过表达MCL1是否影响细胞增殖和迁移，实验中通过构建表达MCL1的真核表达载体，验证了超表达的MCL1能够促进EC9706细胞增殖并促进其迁移。这些结果提示，MCL1对食管癌细胞EC9706的增殖也很重要。

能够调控EC9706细胞增殖的因素较多，一些中药有效成分如六君子汤，乙酸乙酯部位可以调控IL-6/STAT3信号通路进而调控EC9706增殖[6]；壁虎活性肽[7]和兖州卷柏总黄酮[8]能够通过调节其线粒体凋亡通路相关蛋白促进EC9706细胞凋亡抑制其增殖。这些结果表明，有多种药物可以调控EC9706细胞增殖。而MCL1调控细胞增殖的机制研究也比较多，有研究显示，在黑色素瘤细胞中，同时靶向MCL1和ERK1/2信号通路能够改善患者的预后[9]；在胶质瘤细胞中，沉默MCL1基因后能够导致PI3K/AKT信号通路的抑制，进而促进胶质瘤细胞的凋亡[10]。但是，对于MCL1调控EC9706细胞增殖的机制还不清楚。有研究显示靶向MCL1和MEK的抑制剂共同使用，利于非小细胞肺癌[11]、急性髓系白血病细胞[12]和胰腺癌细胞[13]凋亡，这些结果提示，MCL1可能和MEK共同发挥作用对癌细胞抑制明显，推测二者起协同互补作用，但是MCL1和MEK是否存在相互调节还没有研究。本实验中在EC9706细胞中超表达MCL1，检测到下游MEK蛋白磷酸化增加，这些结果提示MCL1不仅和MEK是两个协同互补的靶点，相互之间还存在调控关系。

MEK信号通路激活，除了本身磷酸化水平的增加，其下游靶分子也能被激活。MEK下游靶分子有C-FOS、cyclinD1和C-MYC等。C-FOS、C-MYC和 cyclinD1等是处于MEK下游调控细胞增殖的基因[14]，实验中也发现这些MEK下游基因表达量提高，进一步证明MCL1能够激活MEK信号通路。

总之，实验证明MCL1促进细胞增殖能够通过靶向MAPK-MEK信号通路发挥作用，为MCL1调控癌细胞增殖机制提供新的理论依据。