趋化因子受体2 和生长调节性基因α在食管鳞癌中的表达、临床意义及相关性研究

范玉宏 周海丰 范 爽 王立坤 侯雅雄 刘 博

1.河北北方学院附属第一医院病理教研室，河北张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院普通外科，河北张家口 075000；3.河北北方学院研究生学院，河北张家口 075000；4.河北北方学院附属第一医院超声医学科，河北张家口 075000；5.河北北方学院附属第一医院病理科，河北张家口 075000

据最新流行病学调查显示，我国食管癌发病率总体呈上升趋势，2014 年我国居民食管癌新发病例数继肺癌、胃癌、食管鳞癌、肝癌、乳腺癌之后位居第六，死亡例数继肺癌、肝癌、胃癌位居第四，严重威胁国民健康安全[1-2]。我国食管癌90%以上为鳞癌，其早期筛查诊断、规范的治疗方式和敏感的预后监测指标，对于患者的无病生存期（disease-free survival，DFS）、总生存期（overall survival，OS）的提高，生活质量的改善有着非常重要的影响[3]。因此，进行与食管癌相关的基础研究，尤其是分子生物学研究，为临床早期诊断提供准确度高、特异性强的标志物已成为临床医师的研究热点。

早期研究证实，细胞CXCR2 主要影响骨髓来源单核细胞向中性粒细胞和髓源性抑制性细胞分化和募集，进而在炎症诱导的恶性肿瘤发生中起重要作用；但近年发现，CXCR2 在肺癌、肾癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌等人类诸多恶性肿瘤中表达量增高，发挥促进肿瘤发生、发展的致癌作用，但在食管鳞癌中的研究文献极少[4-6]。GROα 是ELR+CXC 趋化因子，是CXCR2 的最强配体，表达与巨噬细胞、中性粒细胞和上皮细胞，并对中性粒细胞有较强的趋化作用。研究证实，GROα 在肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤组织中呈高表达，但在食管鳞癌中的研究报道较少[7-9]。

本研究通过对食管鳞癌和癌旁正常食管组织中CXCR2、GROα 行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和免疫组织化学技术，旨在探讨CXCR2、GROα 在食管鳞癌和癌旁正常组织中的表达情况，同时收集患者的临床资料，分析二者的表达水平和相关临床病理因素间的关系，为食管鳞癌的早期筛查诊断、治疗评估和预后监测方面提供敏感度高、特异性强的分子标志物，同时为食管鳞癌的精准治疗、靶向治疗提供科研基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017 年1 月—2018 年6 月河北北方学院附属第一医院胸心外科食管癌手术切除后病理确诊为食管鳞癌的组织70 例，其中男38 例，女32 例；年龄39～78，平均（59.1±6.4）岁；正常组织70 例（切缘距离癌组织＞5 cm，且经病理证实为正常组织），同时收集患者完整的临床资料。纳入标准：病理证实为食管鳞癌，未接受化学治疗、生物治疗及放射治疗等，临床资料完整；排除标准：不符合食管鳞癌临床诊断标准者，临床资料不全或难以配合取材者，合并严重心、肝、肾功能异常者。本研究经患者及家属知情同意，医院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂与实验方法

1.2.1 试剂和仪器 RNA 逆转录试剂盒（货号：639505）、RNA 提取试剂盒（货号：3735A）、PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒（货号：3733）均购自日本Takara 公司；CXCR2、GROα 和β-catenin 引物由上海生工有限公司设计合成，全自动电化学发光免疫分析仪（E2010）购自瑞士罗氏公司，DEPC 水购自美国sima 公司，兔抗人CXCR2 单克隆抗体（货号：EPR22301-103）、兔抗人GROα 多克隆抗体（货号：EPR21759-11）均购自美国ABCAM 公司，DAB 显色试剂盒购自北京中杉公司。

1.2.2 qRT-PCR 取食管癌组织及癌旁正常组织各5 mg，按照试剂盒说明书提取癌组织和癌旁组织的总mRNA，测定总mRNA 浓度。取4 μL mRNA，反转录成cDNA，反转录条件为：25℃5 min，42℃15 min，85℃5 s。取2 μL cDNA 进行实时定量PCR 扩增，PCR 扩增引物：CXCR2 正向引物：5’-ATTCTGGGCATCCTTCACAG-3’，反向引物：5’-TGCACTTAGGCAGGAGGTCT-3’；GROα 正向引物：5’-CCGAAGTCATAGCCACACTCAA-3’，反向引物：5’-TGTTGCAGGCTCCTCAGAAATA-3’；GAPDH 作为内参，正向引物：5’-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3’，反向引物：5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3’。反应条件为：95℃1 min 预变性，1 个循环，94℃20 s 变性，55℃30 s 退火，72℃30 s延伸，5 个循环，94℃15 s，60℃30 s 收集荧光，40 个循环，采用ΔΔCt 相对定量法分析结果，差异水平用2-ΔΔCt表示。ΔΔCt=实验组（Ct目的基因-Ct管家基因）-对照组（Ct目的基因-Ct管家基因）。

1.2.3 免疫组织化学法 将癌组织标本连续切片4 μm贴附于经多聚赖氨酸处理的玻片上，80℃烘烤50 min，光镜下观察切片中CXCR2、GROα 蛋白的表达和分布情况，每张切片选取5 个高倍视野（400×）。CXCR2、GROα 蛋白阳性均主要分布于细胞质和细胞膜中，均呈棕黄色颗粒。判断标准：应用计算机图像分析软件Image J 观察分析抽取结果，根据阳性细胞的平均灰度值和阳性面积百分比，给出4 种评分：3 分（强阳性）、2 分（阳性）、1 分（弱阳性）、0 分（阴性）；分别对阳性细胞和阴性细胞进行计数。根据阳性细胞数占总细胞数的百分比评分，阳性细胞数＜5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分，两项评分的乘积为最终评分，总积分＜3 分为阴性，总积分＞3 分为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料采用例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验；qRT-PCR 结果用GraphPad Prism5 软件进行分析和作图；CXCR2 和GROα 蛋白表达与临床病理特征的相关性用Spearman 检验分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR2 和GROα mRNA 在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达

食管鳞癌和癌旁正常组织中CXCR2 mRNA、GROα mRNA 表达：以目的基因与GAPDH 的比值作为qRT-PCR 相对定量分析结果，癌组织中CXCR2 mRNA、GROα mRNA 的表达水平明显高于正常食管组织，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表1。

表1 CXCR2 和GROα mRNA 在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达（）

表1 CXCR2 和GROα mRNA 在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达（）

注：CXCR2：趋化因子受体2；GROα：生长调节性基因α

2.2 食管鳞癌和癌旁正常组织中CXCR2 和GROα蛋白的表达

免疫组化结果显示癌组织中CXCR2 阳性表达为84.29%（59/70），明显高于其在正常组织中的37.14%（26/70），癌组织中GROα 阳性表达为72.86%（51/70），明显高于其在正常组织中的32.86%（23/70），差异均有高度统计学意义（χ2=18.441、16.508，均P ＜0.01）。见图1。

图1 免疫组化检测CXCR2、GROα 在正常食管组织和癌组织中的表达情况(SP，400×)

2.3 CXCR2 和GROα 蛋白的表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系

CXCR2 和GROα 蛋白表达均与肿瘤的分化程度、TNM 分期、淋巴结转移及肝转移有关（均P ＜0.05），而与肿瘤大小无关（P ＞0.05），TNM 分期越高，二者的表达水平越高，伴淋巴结转移、肝转移的患者二者的表达水平明显高于未转移的患者（均P ＜0.05）。见表2。

表2 CXCR2 和GROα 蛋白的表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系[例（%）]

2.4 食管鳞癌组织中CXCR2 和GROα 蛋白表达的相关性

Spearman 检验结果显示CXCR2 和GROα 蛋白表达呈正相关（r=0.476，P ＜0.01）。见表3。

表3 食管鳞癌组织中GROα 和CXCR2 蛋白表达的相关性

3 讨论

趋化因子受体可参与病原体的清除、炎症反应、病原体感染、细胞及器官的发育、创伤的修复等病理生理过程，而且其与相应的配体结合能介导肿瘤细胞迁移和浸润。目前，已有相关研究表明趋化因子与肿瘤的形成及其转移相关，多种趋化因子均与肿瘤细胞所表达的相应受体有关[10]。

CXCR2 是趋化因子受体家族中的重要一员，最早由Holmes 和Murphy 克隆成功，CXCR2 基因定位于人染色体2q35 上，内含2 个内含子和3 个外显子。CXCR2 蛋白全长约为350 个氨基酸，由1 个糖基化的N 末端和7 个富含疏水氨基酸跨膜区的结构组成[11]。CXCR2 是一种7 次跨膜的G 蛋白偶联受体（GPCR），其在细胞内、外各有3 个结构域，每一个位于胞外的结构域均含有一个特定的半胱氨基酸残基，而其中的一个N 末端结构域与配体的结合有关。由α、β 和γ3个亚基构成的鸟嘌呤核苷酸调节蛋白位于细胞膜内，CXCR2 完成信号转导需依靠这种偶联的G 蛋白[12-13]。

GRO 家族共3 个成员，GROα（CXCL1）、GROβ（CXCL2）和GROγ（CXCL3），其受体均为CXCR2，其中以GROα 与CXCR2 结合最强。GROα 基因定位于人染色体4q21，由3 个内含子和4 个外显子构成。GROα cDNA 编码73 个氨基酸，其效应与细胞生长相关[14]。GROα 与其受体CXCR2 结合后，参与机体炎症、感染、创伤愈合等病理过程，此外，还能诱导在肿瘤的发生、演进。具体机制为：①直接促进肿瘤细胞的生长、迁移和转移；②促进肿瘤血管形成、白细胞浸润，为肿瘤的形成和发展提供必要的物质基础[15]。

Xiang 等[16]研究证实，在胃癌组织中CXCR2 和GROα 蛋白的表达显著高于正常组织，且与胃癌的浸润程度、大小、TNM 分期、淋巴结和神经浸润均有关，生存期研究显示二者的表达水平与胃癌患者的预后呈正相关。Kasashima 等[17]研究证实，癌细胞中的GROα通过CXCR2 信号刺激了骨髓间充质细胞（BM-MC）向肿瘤基质的募集，癌细胞中GROα 的表达与T 细胞侵袭、淋巴结转移、淋巴侵袭、静脉侵袭、腹膜转移及间质细胞CXCR2 表达相关。CXCR2 在基质细胞中的表达与组织学类型、T 细胞侵袭、淋巴结转移、淋巴侵袭、浸润、腹膜转移和CD271 在基质细胞中的表达有关。GROα 和CXCR2 阳性癌症患者的总体生存率较阴性癌症患者低。胃癌细胞中GROα 表达和基质细胞中CXCR2 表达都是胃癌患者的独立预后因素。Yung等[18]在卵巢癌中发现GRO-α 可通过CXCR2 受体激活TAK1/NFκB 信号传导，通过shRNA 基因敲低、CXCR2 抑制剂SB225002 等方法处理，卵巢癌细胞中TAK1/NFκB 信号传导显著减弱，并降低体内外致癌和转移的潜力，表明CXCR2 在GRO-α 控制的腹膜腔卵巢癌细胞的转移扩散中起关键作用。这项研究强调了GRO-α 在腹膜肿瘤微环境中作为关键趋化因子的重要性，并建议将受体CXCR2 作为卵巢癌腹膜转移的潜在治疗靶标。Li 等[19]在肝癌组织中发现，GROα-CXCR2 轴能够调节中性粒细胞的浸润，而阻断GROα-CXCR2 轴，中性粒细胞浸润显著减少，从而抑制肝癌细胞的转移和复发。

本研究显示，CXCR2 和GROα 在食管鳞癌组织中的表达明显高于正常食管组织，提示食管黏膜在癌变的过程中，CXCR2 和GROα 相互作用，启动趋化过程，从而介导肿瘤的发生；进一步研究显示，在食管鳞癌中CXCR2 和GROα 表达水平与其分化程度、TNM分期、淋巴结和肝转移均明显相关，且二者表达呈明显正相关，提示CXCR2 和GROα 相互结合，共同参与整个趋化过程，二者表达越高，病变越严重、预后越差。有研究证实[20-22]，CXCR2 和GROα 结合后能激活机体肿瘤细胞内包括RAS、MAPK、AKT、NF-KB 等多个信号传导途径，同时诱导多种肿瘤相关因子的表达，如基质金属蛋白酶（MMMP）-2、MMP-9 等，因而在肿瘤细胞的发生、侵袭、转移过程中发挥重要作用[23-25]。

综上，CXCR2 和GROα 的异常表达和食管鳞癌的发生、发展、浸润及转移密切相关，其具体的相互作用机制及相关通路需要进一步研究，这也将是本研究下一步努力的方向。