夏枯草治疗Graves 眼病作用机制的网络药理学探讨

肖 瑶 曹晔文 李 菲 晏蔚田 李 俊 魏军平

1.中国中医科学院广安门医院内分泌科，北京 100053；2.北京中医药大学研究生院，北京 100029

Graves 眼病（GO）是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病，占Craves 病（GD）的25%～50%[1]，具有眼球突出、活动受限、睑裂增宽、眼睑水肿等表现。目前GO 西医治疗效果欠佳，副作用大，中医药治疗对突眼度、病情活动性评分的改善有一定作用[2]。GO 中医病位在目，与肝密切相关，多数医家认为肝火旺盛为GO的主证[3]。夏枯草有清肝明目、消肿散结等功效，且具有免疫调节[4]、抗炎[5]等作用，在治疗甲状腺结节、GD等方面具有良好效果[6]。网络药理学是基于疾病、靶点、药物间的相互作用网络，是分析研究某中药或复方潜在活性成分和作用靶点的新方法[7]，可加速对药物靶点的发现，提高新药研发效率，节省药物的研发费用[8]。本文利用网络药理学方法探讨夏枯草对GO 的作用机制。

1 资料与方法

1.1 夏枯草主要活性成分及作用靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）[9]寻找夏枯草活性成分，并根据已发表文献进行其他活性成分及靶点的补充。以口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为标准初筛，并进行靶点预测，通过Uniprot 蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）进行信息标准化。

1.2 GO 相关靶点筛选

因数据库存在更新周期较久的情况，单独某个数据库无法完全纳入相关靶点，故本研究以“Graves’ophthalmopathy”为关键词，检索GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM 数据库（http：//www.omim.org）、DisGeNET 数据库（http：//www.disgenet.org）中GO 相关靶点，并进行文献检索补充。将得到的疾病靶点合并去重，得出GO 相关靶点。

1.3 构建夏枯草-GO 靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络

将夏枯草与GO 相关靶点取交集后，提交至STRING数据库（https：//string-db.org）[10]，构建PPI 网络。每个节点代表一个单一蛋白编码基因位点产生的所有蛋白质，相互作用线段代表蛋白质的相互结合，介度为网络中每个节点的连线数。通过CytoScape 3.6.1 进一步处理分析，明确关键靶点。

1.4 夏枯草-GO 靶点KEGG 信号通路与基因本体功能富集分析

将交集靶点录入Metascape 平台[11]（http：//metascape.org/gp/index.html），以富集数量≥3、P <0.01 为标准进行KEGG 信号通路与基因本体功能富集分析。

1.5 药物-成分-疾病-靶点-通路网络图的构建

利用Cytoscape 构建“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络图，利用软件内置功能分析其介度等网络拓扑参数，将其由高致低排序，得出核心靶点及主要活性成分。

1.6 分子对接验证

根据该网络介度排序得出的最主要活性成分及前4 个核心靶点进行分子对接验证。于PDB 数据库下载核心靶点的蛋白结构文件，运用Pymol 软件去除水分子和配体分子，利用AutoDock Tools 软件将配体、受体的三维结构进一步处理，并使用AutoDock Vina软件[12]进行分子对接，得出Full Fitness 值。靶点蛋白与活性成分亲和力越好，Full Fitness 值越低，进而验证其结合的紧密程度。

2 结果

2.1 夏枯草主要活性成分及作用靶点获取

初步提取并筛选后获得11 个夏枯草有效活性成分（表1）和200 个活性成分相关靶点。

表1 夏枯草主要活性成分

2.2 GO 相关靶点的获取

从GeneCards、OMIM、DisGeNET 数据库分别获得GO 相关靶点294、19、7 个，查阅文献获得靶点2 个，合并、去重后得到314 个GO 相关靶点。

2.3 夏枯草-GO 靶点PPI 网络构建

得到交集靶点48 个并于STRING 数据库获得PPI 网络。该网络共282 条相互作用线段，平均介度值为11.8。进行Cytoscape 处理后，得到图1 所示网络，节点圆圈越大说明越重要，线条越粗说明相互作用越强。

图1 夏枯草-Graves 眼病靶点PPI 网络图

2.4 KEGG 信号通路富集结果

运用Metascape 数据库得到195 条信号通路，筛选前20 条最具有代表性的信号通路（表2），并绘制气泡图（图2）。其中，肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、核因子-κB（NF-κB）信号通路和磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路等与GO 密切相关。

图2 KEGG 通路富集分析气泡图

表2 KEGG 通路富集分析结果

2.5 基因本体功能富集分析结果

通过基因本体功能分析，得到生物过程（BP）条目1456 个，细胞组成（CC）条目27 个，分子功能（MF）条目52 个。分别选取P 值最小的前10 个条目进行可视化处理（图3）。可知交集靶点对于细胞黏附的调控、白细胞分化、细胞增殖的负调控等生物过程具有一定影响，可能参与分泌颗粒管腔、胞质小泡腔、水泡腔等细胞组成，与受体配体活性、受体调节活性、细胞因子受体结合等分子功能方面相关。

2.6 药物-成分-疾病-靶点-通路网络图的构建

构建“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络图（图4），粉色为疾病名称，绿色为活性成分，紫色为中药，黄色为交集靶点，蓝色为通路。节点大小与介度值呈正相关。

2.7 分子对接验证

选择槲皮素与4 个核心靶点进行分子对接验证（图5），其结合紧密程度较高的靶点依次为血管内皮生长因子A（VEGFA）、白介素6（IL-6）、TNF、白介素1β（IL-1β），Full Fitness 值分别依次为-7.4、-7.1、-6.8、-5.4，说明槲皮素与VEGFA、IL-6 等的相互作用可能在夏枯草治疗GO 过程中发挥主要作用。

3 讨论

通过研究，槲皮素、木犀草素、山奈酚等可能为夏枯草治疗GO 的主要有效成分。槲皮素对治疗GO 活动性炎症和慢性纤维化具有潜在用途[13]，可能与其降低活性氧抑制脂肪生成、减轻球后脂肪增厚相关[14]。木犀草素可抑制自身免疫性甲状腺炎（AITD）小鼠早期甲状腺内信号转导与转录激活因子（STAT）1 和STAT3 的表达，减轻单核细胞浸润和甲状腺上皮细胞破坏[15]。山奈酚可增强编码甲状腺激素激活的2 型脱碘酶活性，增加三碘酪氨酸的活化[16]。

夏枯草治疗GO 的可能核心靶点主要包括IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、细胞间黏附分子1（ICAM1）等。急性期治疗前GO 患者外周血IL-6 和TNF 水平均明显高于治疗后及慢性缓解期GO 患者[17]。GO 的发病和持续依赖于TNF-α 等细胞因子的诱导，进而活化单核细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞表面的黏附分子[18]。TNF、IL-6 等共同作用可引起淋巴细胞浸润及B细胞激活，产生甲状腺自身抗体，引起AITD[19]。研究发现，小鼠甲状腺发育需要内皮细胞分泌VEGFA，使内皮细胞吸收和扩张[20]。此外，GO 的易感基因型与血浆IL-1β 水平降低有关[21]。而体外实验发现，IL-1β 诱导球后成纤维细胞表达的趋化因子RANTES 参与GO眶后淋巴细胞浸润[22]。GO 活动期患者血清ICAM1水平显著高于对照组，经激素治疗后，其水平较治疗前显著降低[23]。

图3 基因本体功能富集分析图

图5 分子对接结果

在KEGG 通路富集分析方面，除了与核心靶点密切相关的TNF 信号通路外，NF-κB1 基因启动子区域插入/缺失（-94ins/delATTG）的基因多态性与GO 的发展及发病年龄相关[24]。此外，抑制PI3K 信号可能为GO 的一种新的治疗途径，其与一种可促进GO 患者眼眶成纤维细胞脂肪生成的促甲状腺激素受体人单克隆抗体M22 可能具有联级作用[25]。

综上，槲皮素可能为夏枯草干预GO 的最主要有效成分，IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β 可能为最主要的作用靶点。夏枯草主要通过TNF 信号通路、NF-κB 信号通路及PI3K-Akt 信号通路对免疫和炎症反应等方面产生影响，进而对GO 的治疗发挥作用。