基于网络药理学的杞菊地黄丸治疗糖尿病合并高血压的机制研究

2021-05-25张世超

中国医药导报 2021年11期

张园张世超

辽宁中医药大学附属医院医疗设备处，辽宁沈阳 110032

糖尿病是一种常见的临床慢性代谢性疾病，其全球患病人数高达4.63 亿，中国更是位居第一。高血压作为糖尿病的一种常见并发症，同时也是2 型糖尿病发生心血管病变的重要危险因素，其可加速损伤血管内皮，加重病情。国外有研究发现，糖尿病患者中有40%～80%的患者同时并发高血压[1]。西医治疗主要采用控制血糖、降低血压等方法，虽有一定的疗效，但长期应用易导致肝、肾功能损害。中医药具有整体观、辨证论治的治疗特点，应用中药治疗本病具有很好的优势和疗效。杞菊地黄丸作为经典名方，具有滋肾养肝的作用，临床多项研究发现，杞菊地黄丸治疗本病可明显改善患者血糖、血压、血脂等指标，降低胰岛素抵抗[2-3]。网络药理学是一种基于多种大数据平台及先进的科学技术的现代化研究方法，从宏观到微观科学地对抽象的中医药理论加以诠释[4]，阐明中药的有效性和科学性，使之与现代医学相接轨。本研究拟基于此研究方法，预测杞菊地黄丸治疗糖尿病合并高血压的有效活性成分及作用靶点，并进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 杞菊地黄丸化学成分及靶点信息的获取

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中分别以“枸杞子、菊花、泽泻、熟地、山药、茯苓、山茱萸、丹皮”为检索词，以“口服吸收率（OB≥30%），类药性（DL≥0.18）和半衰期（HL≥4 h）”作为筛选条件，得到其有效的活性成分。在此基础上通过PubChem 数据库获得这些成分的Smiles 格式，同时应用Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），设置研究物种为人类（Homo sapiens），筛选Probability＞0 的靶点。采用Uniprot 数据库进行标准化处理，挖掘枸杞子、菊花、熟地、山茱萸、山药、丹皮、茯苓、泽泻八味中药的作用靶点。

1.2 糖尿病合并高血压靶点的筛选

以“糖尿病（diabetes）、高血压（hypertension）”作为检索词，在GeneCards 数据库（http：//www.omim.org/）、TTD 数据库（http：//www.genecards.org/）、DisGeNET 数据库（http：//www.disgenet.org/）中分别搜索，合并去除重复和假阳性值，获得疾病靶点。

1.3 中药-疾病靶点网络构建及核心靶点的筛选

应用Venny 软件将杞菊地黄丸中八味中药的作用靶点与糖尿病合并高血压的疾病靶点进行交集，绘制韦恩图，筛选出中药与疾病的共有靶点。将共有靶点导入String 数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络模型，其中蛋白种类为人类“Homo sapiens”，“highest confidence”＞0.9，应用Cytoscape 软件进行可视化分析，以节点度值分布（degree）和介数中心性（betweenness centrality）同时在中位数以上作为筛选条件，从而获得核心靶点。degree 和betweenness centrality 值越大，证明节点越重要。

1.4 核心靶点生物功能注释及通路分析

将中药复方知柏地黄丸与六味地黄丸的核心靶点导入Metascape 平台，设置物种为人类，对其进行GO-BP 生物功能富集和京都基因和基因组数据库（KEGG）Pathway 分析，从而进一步比较中药复方知柏地黄丸与六味地黄丸治疗代谢综合征在生物学功能及信号通路方面的差异性。Metascape 覆盖范围广泛，包含了UniProt、NCBI、DrugBank 等多个数据库信息，同时具有一定的时效性[9]。应用Cytoscape 软件构建核心靶点-生物功能-代谢通路网络图。

2 结果

2.1 杞菊地黄丸与糖尿病合并高血压靶点的筛选

通过在TCMSP 数据库中检索杞菊地黄丸中八味中药的活性成分及筛选，共收集到活性化合物枸杞子100 个。通过PubChem 及Swiss Target Prediction 数据库，筛选得到杞菊地黄丸的作用靶点890 个。在GeneCards、TTD 及DisGeNET 数据库对疾病靶点进行检索、筛选，共获得糖尿病靶点1267 个、高血压靶点1352 个。通过Venny 软件取交集后获得杞菊地黄丸与糖尿病合并高血压共有靶点138 个。见图1。

图1 杞菊地黄丸与糖尿病合并高血压共有靶点韦恩图

2.2 PPI 网络与核心靶点分析

应用String 数据库构建中药与疾病共同靶点的PPI 网络图，见图2。同时保存tsv 格式文件，并将其导入Cytoscape 软件，分析网络中所有点的拓扑参数（degree 和betweenness），筛选出degree≥6 和betweenness centrality≥5.69×10-3的靶点作为核心靶点，共得到39 个核心靶点，包括转录激活因子-3（STAT3）、磷脂酰肌醇激酶3（PIK3）、过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）、丝氨酸/苏氨酸激酶2（AKT2）、血管内皮生长因子A（VEGFA）等。

图2 杞菊地黄丸与糖尿病合并高血压蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.3 核心靶点生物功能和KEGG 通路富集分析

利用Metascape 软件分别对筛选出的杞菊地黄丸治疗糖尿病合并高血压的核心靶点进行GO-BP 生物学功能富集分析和KEGG 通路分析，发现杞菊地黄丸可通过血液循环、肽基丝氨酸磷酸化、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路等GO-BP 生物学功能发挥作用，见图3。可通过VEGF 信号通路、ErbB 信号通路、Toll 样受体细胞信号通路等治疗糖尿病合并高血压，见图4。以VEFG 为其主要通路，见图5。利用Cytoscape软件构建核心靶点-GO-BP 生物功能-KEGG 通路网络图，见图6。

图3 杞菊地黄丸治疗糖尿病合并高血压GO-BP 生物学功能富集分析结果

图4 杞菊地黄丸治疗糖尿病合并高血压KEGG 通路富集分析结果

图5 VEFG 信号通路

3 讨论

糖尿病、高血压在中医学中多归属于“消渴”“眩晕”等疾病，糖尿病多以阴虚为本燥热为标，中医多采用平肝潜阳、益气补肾等疗法。杞菊地黄丸属于中药制剂，临床上经常用于治疗糖尿病和高血压等疾病。杞菊地黄丸出自清代董西园的《医级·卷八》，是在六味地黄丸的基础上加枸杞子、菊花而成。方中枸杞子、山茱萸、山药、熟地等可滋补肾阴，潜阳育阴；菊花可疏风平肝，清热明目，茯苓、丹皮、泽泻可健脾益气，活血化瘀。全方合用，共奏滋阴潜阳、补肾平肝之功。现代药理学研究表明，枸杞子的主要活性成分为枸杞多糖、多酚等，可以刺激人体内源性因子，提升抗氧化酶的活力[5]。菊花主要含黄酮类、挥发油等，通过增加肝细胞中的PPAR，从而降低血糖，并具有保护血管舒张反应性、增强心肌收缩力的作用[6]。熟地中主要有多糖、5-羟甲基糠醛等，具有促进内皮细胞增殖、增强免疫力的作用[7]。山药中主要含有多糖、氨基酸、山药素类化合物，可增加胰岛素分泌，改善受损坏的胰岛β细胞功能，从而降低血糖，亦可以降低血脂，调节免疫[8]。山茱萸中主要含有环烯醚萜、黄酮、多糖等，可降低血压，调节糖、脂等代谢过程[9]。茯苓的主要药效成分为三萜类和多糖类等化合物，具有抑制炎症反应、保护肝功能的作用[10]。丹皮中含有酚及酚苷类等化学成分，具有较强的降糖及保护心血管等多种作用[11]。泽泻主要含有糖类、三萜、倍半萜等，具有利尿、降血脂、降血糖及抗氧化损伤等作用[12]。

本研究基于网络药理学技术，发现杞菊地黄丸的含有100 个活性化合物、890 个作用靶点，与糖尿病合并高血压共有靶点138 个，验证了中药具有多成分、多靶点的特点。通过PPI 网络进行分析，筛选出核心靶点39 个，即STAT3、PIK3、PPAR、AKT2、VEGFA 等。STAT3 参与调节细胞增殖与分化、细胞凋亡等生理过程，当机体血糖和血压值较高时，其表达增加[13]。STAT3 可激活VEGF 信号通路，从而诱导内皮细胞的异常增殖[14-15]。PIK3R、AKT2 是构成PI3K/Akt 信号转导通路的关键靶点。既往实验证实杞菊地黄丸能够上调PI3K、Akt 的表达[16]。PI3K/Akt 在机体高表达时，可以激活eNOS 和PPAR，抑制氧化应激反应，减少炎症因子的释放，从而起到保护血管的作用[17-18]。PPAR具有调节脂肪细胞分化和胰岛素抵抗的作用，其激活后可保护血管平滑肌和血管内皮[19-20]。GO-BP 生物学功能富集分析和KEGG 通路分析发现杞菊地黄丸可通过血液循环、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、肽基丝氨酸磷酸化等生物学功能及VEGF 信号通路、ErbB 信号通路、Toll 样受体细胞信号通路等发挥其治疗糖尿病合并高血压的作用。VEGF 是一种血管通透性因子，既可促进血管内皮细胞的增殖，又可诱导血管增生，同时可调节血管的通透性，参与血管内皮细胞迁移、机体修复损伤等生物学过程[21-22]。研究发现，在糖尿病合并高血压患者体内，VEGF 含量明显升高，且高于单纯糖尿病患者和高血压患者[23]。体内VEGF 含量过高会导致内皮细胞过度增殖，从而引起内皮细胞的功能障碍。ErbB 信号通路参与细胞的存活、增殖和其他生理反应。国外一项研究发现，ErbB2 双重靶向抑制剂雷帕替尼可通过抑制高糖诱导的ErbBs 信号改变，从而阻止细胞凋亡和改善血管功能[24]。Toll 样受体可使机体释放大量炎性因子激活免疫炎症反应，参与胰岛素抵抗、胰岛细胞的炎症反应等过程，其在糖尿病合并高血压的患者体内表达增加[25]。