淫羊藿素对不同p53分型顺铂耐药卵巢癌细胞株周期阻滞作用的研究

郑少烈， 李若玢， 高绿芬， 高雪松， 李囡， 王晓玉

(暨南大学 附属第一医院 妇产科， 广东 广州 510632)

卵巢癌的复发耐药问题，一直是影响患者生存期及生活质量的主要原因.细胞周期阻滞能够促进突变DNA的修复以及异常细胞分裂的逆转，为人体恶性肿瘤的重要监控机制之一.p53在调控细胞周期阻滞过程中发挥着十分重要的作用，肿瘤耐药的产生与p53功能的失调关系密切.淫羊藿素(ICT)作为传统补益中药，具有抗癌谱广、逆转化疗耐药、调节免疫力等特点.本实验通过建立细胞周期同步化模型，研究淫羊藿素影响不同p53分型顺铂耐药卵巢癌细胞株周期阻滞的作用途径及机制，为复发耐药性卵巢癌治疗药物的研发提供新思路.

1 材料与方法

1.1 实验细胞

三株p53不同分型人卵巢癌细胞株p53野生型C13*、p53变异型A2780cp、p53缺失型SKOV3，由渥太华大学细胞与分子医学系Tsang Ben教授课题组馈赠[1-2]，储存于暨南大学附属第一医院中心实验室.

1.2 主要试剂

淫羊藿素购自广州杰特伟生物有限公司，胸腺嘧啶核苷酸(TdR)购自Sigma公司，PRMI-1640培养基、质量分数为0.25%胰酶/质量分数为0.02%EDTA、青-链霉素、胎牛血清均购自GIBCO公司，二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、吐温20(Tween-20)均购自Sigma公司，甲醇、无水乙醇均购自广州化学制剂厂，苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解液、ECL 发光试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS 上样缓冲液、anti-GADPH(鼠单克隆抗体)、二抗(抗兔或抗鼠)、一抗二抗去除液(强碱性)均购自碧云天生物技术公司，anti-CyclinE(兔多克隆抗体)、anti-CyclinB1(鼠单克隆抗体)、Anti-CHK1(鼠单克隆抗体)、Anti-p53(鼠单克隆抗体)均购自Santa Cruz公司.

1.3 主要方法

1.3.1 采用TdR双阻滞法进行细胞周期同步化

(1)于6孔细胞培养板中接种SKOV3、C13*、A2780cp细胞悬液，以2.5×105/孔接种，培养箱中过夜.

(2)取TdR粉100 mg溶解于10 mL PBS，0.22 μm无菌滤器过滤，完全培养液稀释成浓度为2.0 mmol/L.待细胞贴壁后，PBS反复清洗2次，加浓度为2.0 mmol/L TdR完全培养液培养T阻滞.吸出含TdR完全培养液，PBS清洗3次，加入完全培养液继续培养T释放，后加浓度为2.0 mmol/L TdR完全培养液处理细胞T阻滞小时.

(3)去除TdR后，每隔4 h收集1孔细胞，PBS清洗后消化吹打细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，4 ℃ PBS洗涤吹打，1 000 r/min离心5 min，去上清加200 μL 4 ℃ PBS重悬，再加2 mL -20 ℃体积分数为75%乙醇反复吹打，4 ℃过夜，-20 ℃保存.

(4)取固定好的细胞，2 000 r/min离心，去上清，加1 mL PBS混匀，1 000 r/min离心去上清，加入50 mg/mL PI，1 g/L RNase，质量分数为0.1% TritonX-100，避光室温孵育15 min，40 μm滤网过滤后上机进行流式细胞周期检测.

1.3.2 淫羊藿素对同步化卵巢癌细胞株周期的阻滞作用

(1)6孔板中接种SKOV3、C13*、A2780cp细胞株，每孔2.5×105个细胞，培养过夜.

(2)进行细胞同步化，待第2次去除TdR后，加入20 μmol/L淫羊藿素进行培养，共分为7个组(表1).

表1 7个不同分组细胞加药处理Table 1 Seven different groups of cells were treated with different time

(3)收集各组细胞，进行细胞固定及周期检测.

1.3.3 Western blot检测CyclinE及CyclinB1蛋白表达水平

(1)将SKOV3、C13*、A2780cp细胞株以2.5×105/孔接种于6孔细胞培养板中培养过夜.

(2)细胞同步化，待第2次去除TdR后，加入浓度为20 μmol/L淫羊藿素进行培养，共分为5个组(表2).

表2 5个不同分组细胞分组加药处理Table 2 Five different groups of cells were treated with different time

(3)SKOV3、C13*、A2780cp细胞株进行药物处理后，弃去培养液，4℃PBS洗涤2次，吸尽液体，置于冰上.

(4)每孔加质量分数为1%PMSF的RIPA裂解液100 μL，冰上裂解10 min，细胞刮刮下，继续裂解10 min，转移到1.5 mL EP管中，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清备用.

(5)用BCA蛋白测定试剂盒检测总蛋白.

(6)用含质量分数为1%PMSF细胞裂解液将所有蛋白配成相同浓度，加入样本体积量1/4的SDS-PAGE 5× loading buffer，混匀后于100 ℃煮沸5 min备用或-80 ℃保存.

(7)配置SDS-PAGE凝胶，电泳，转膜，封闭，抗体孵育及显色.

1.3.4 Western blot检测p53及CHK1蛋白表达水平

将SKOV3、C13*、A2780cp细胞收集后以2.5×105/孔接种于6孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养过夜.细胞同步化，按照1.3.3步骤进行Western blot检测，anti-p53、anti-CHK1(稀释比例为1∶1 000)，分为6组(表3).

表3 6个不同分组细胞加药处理24 hTable 3 Cells in different groups were treated with drugs for 24 hours

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 TdR双阻滞法细胞周期同步化结果

(1)对顺铂耐药性卵巢癌C13*细胞株进行同步化处理，在解除第2次TdR阻滞后各个时段周期分布情况见表4,图1.TdR去除后0、20及24 h的G1期百分比高于control组及其他各时间段组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；TdR去除后4、8 h的S期百分比高于control组及其他各时间段组(P<0.05)；TdR去除后8、12及16 h的G2期百分比高于control组及其他各时间段组(P<0.05).

表4 C13*细胞株同步化后各时段细胞各周期时相百分比

1)与control组相比，P<0.05

(2)顺铂耐药性卵巢癌A2780cp细胞株同步化处理结果见表5，图2.TdR去除后0、16及20 h的G1期百分比高于control组及其他各时间段组，差异均有统计学意义(P<0.05)；TdR去除后4、8及24 h的S期百分比高于control组及其他各时间段组(P<0.05)；TdR去除后8、12 h的G2期百分比高于control组及其他各时间段组(P<0.05).

表5 A2780cp细胞株同步化后各时段细胞各周期时相百分比

1)与control组相比，P<0.05；

(3)顺铂耐药性卵巢癌SKOV3细胞株同步化处理结果见表6,图3.TdR去除后0、24、28及32 h的G1期百分比高于control组及其他各时间段组，差异均有统计学意义(P<0.05)；TdR去除后4、8、12及36 h的S期百分比高于control组及其他各时间段组(P<0.05)；TdR去除后12、16及20 h的G2期百分比高于control组及其他各时间段组(P<0.05).

表6 SKOV3细胞同步化后各时段细胞各周期时相百分比

1)与control组相比，P<0.05

2.2 淫羊藿素对同步化顺铂耐药性卵巢癌细胞株周期阻滞作用

(1)淫羊藿素在最低有效抑制浓度20 μmol/L下对耐药性卵巢癌C13*细胞株分别作用4、8、16、24、36及48 h各周期时相分布情况见表7,图4.淫羊藿素作用细胞4 h起G1期百分比即开始升高，并随作用时间延长而升高，48 h达到峰值，与control组差异均具有统计学意义(P<0.05)；S期及G2期百分比随作用时间延长而降低(P<0.05).

表7 淫羊藿素作用同步化后C13*细胞株各周期时相百分比

(2)淫羊藿素在最低有效抑制浓度20 μmol/L下对耐药性卵巢癌A2780cp细胞株分别作用4、8、16、24、36及48 h各周期时相分布情况见表8及图5.淫羊藿素作用细胞4 h起G2期百分比即开始升高，并随作用时间延长而升高，48 h达到峰值，与control组差异均具有统计学意义(P<0.05)；G1期百分比随作用时间延长而降低(P<0.05).

1)与control组相比，P<0.05

表8 淫羊藿素作用同步化A2780cp细胞株各周期时相百分比

(3)淫羊藿素在最低有效抑制浓度20 μmol/L下对耐药性卵巢癌SKOV3细胞株分别作用4、8、16、24、36及48 h各周期时相分布情况见表9,图6.淫羊藿素作用细胞4 h起G2期百分比即开始升高，并随作用时间延长而升高，48 h达到峰值，与control组差异均具有统计学意义(P<0.05)；G1期百分比随作用时间延长而降低，差异具有统计学意义(P<0.05).

2.3 淫羊霍素对顺铂耐药性卵巢癌细胞株CyclinE及CyclinB1蛋白表达的影响

Western-blot检测经过不同时间淫羊藿素处理后，C13*、A2780cp、SKOV3细胞株的CyclinE及CyclinB1蛋白表达水平变化，采用ImageJ软件测量各组条带灰度值，并以目标蛋白与对应内参蛋白灰度比值进行归一化校正，结果如下.

1)与control组相比，P<0.05

表9 淫羊藿素作用同步化SKOV3细胞株各周期时相百分比

1)与control组相比，P<0.05

(1)淫羊藿素作用C13*细胞株能够显著降低Cyclin E蛋白的表达水平，4、8、12及24 h与control组相比差异有统计学意义(P<0.05)；另外，随作用时间延长下调效果呈下降趋势，但各组间差异无统计学意义(P>0.05)；Cyclin B1蛋白的表达水平各组间无明显差异(P>0.05，图7).

1)与control组相比，P<0.05

(2)淫羊藿素作用A2780cp细胞株能够显著降低Cyclin B1蛋白的表达水平，4、8、12及24 h与control组相比差异有统计学意义(P<0.05)；另外，随作用时间延长下调效果呈下降趋势，各组间差异具有统计学意义(P<0.05)，Cyclin E蛋白的表达水平各组间无明显差异(P>0.05，图8).

(3)淫羊藿素作用SKOV3细胞株能够显著降低Cyclin B1蛋白的表达水平，8、12及24 h与control组相比差异有统计学意义(P<0.05)；随作用时间延长下调效果呈下降趋势，而组间差异无统计学意义(P>0.05)；Cyclin E蛋白的表达水平各组间无明显统计学差异(P>0.05,图9).

2.4 淫羊霍素对顺铂耐药性卵巢癌细胞株p53及CHK1蛋白表达的影响

Western-blot检测经过24 h浓度为20 μmol/L淫羊藿素处理后，C13*、A2780cp、SKOV3细胞株p53及CHK1蛋白表达水平均变化.淫羊藿素能够上调C13*细胞株p53及CHK1蛋白表达，对于A2780cp、SKOV3细胞株仅能上调CHK1表达，与未经淫羊藿素处理组差异具有统计学意义(P<0.05,图10).

1)与control组相比，P<0.05

1)与control组相比，P<0.05

1)与control组相比，P<0.05

3 讨论

卵巢癌是致命的妇科恶性肿瘤.手术和化学疗法是卵巢癌的主要治疗方法[3].铂类化合物是治疗卵巢癌的一线化疗药物，但绝大多数患者治疗后会复发并对其产生耐药性[4].

化疗耐药的发生机制多样，包括肿瘤药物运输率降低、DNA修复效应增强以及机体对DNA损伤耐受等[5].药物毒性产生的DNA损伤在p53突变或缺失的细胞中不能经过p53途径诱导细胞发生周期阻滞及凋亡，是化疗耐药产生的最常见原因.突变p53能够与p63、p73、SP-1等蛋白结合，促进癌细胞的侵袭及转移[6].此外，突变型p53也可以激活SREBP，NF-Y，VDR，ETS2或NRF2等蛋白功能，促进活性氧的积累及癌细胞的无限增殖[7-8].突变p53还能诱导细胞进行程序性重排和扩增，分化成具有无限分裂能力的多能干细胞，促进恶性肿瘤形成[9-10].

Stevens等[11]研究发现，黄酮类的化合物能够引起多种细胞发生细胞周期阻滞.Huang等[12]认为淫羊藿素能够通过上调pRb、p27Kip1和p16Ink4a，下调磷酸化的pRb、Cyclin D1、CDK4等蛋白的表达引起胰腺癌PC-3细胞株发生G1期阻滞以及剂量依赖性的G2/M阻滞.

从同步化后的细胞各周期比例结果来看，3株细胞的各期峰值均表现为G1期最高，S期较低，G2期最低.分析其原因可能是G1期时长最长，S期较短，G2期最短，收集细胞的间隔时间固定为每4 h一次，因而时间跨度较大的G1期获取峰值的几率最高，而较短的S及G2期的收集时间点可能刚好错过对应的峰值出现时间点.另外，同步化处理在细胞进入指数增长期后方可进行，此时的细胞密度已经接近40%～50%，而整个同步化培养时间较长，接近1.5个细胞倍增时长，在同步化处理的后期细胞密度较大，培养液中的营养物质可能只够维持正常细胞的生长，限制了DNA复制及细胞分裂的进行，因而S期及G2期峰值较低，在实验过程中，本小组尝试在同步化过程中给予足量的培养液，在一定程度上提高了S及G2期的峰值水平.此外，不排除部分细胞在TdR阻滞解除后周期运转未能恢复，仍停滞在G1/S的边界处，导致G1的峰值增高.

本研究结果提示，淫羊藿素能够诱导顺铂耐药卵巢癌细胞发生周期阻滞，阻滞类型与p53分型有一定相关性.其中，p53野生型C13*细胞株发生G1期阻滞(表7，图4)，p53变异型A2780cp细胞株(表8，图5)及p53缺失型SKOV3细胞株(表9，图6)发生G2期阻滞，周期阻滞效果具有明显的时间依赖性.

DNA损伤可通过激活细胞周期G1/S及G2/M两个检查点来对周期阻滞进行调控[13].相关研究发现，野生型p53主要对G1/S检查点发挥调控作用，而对G2/M检查点也能够发挥一定的调控作用[14-15].p53介导的细胞周期阻滞通路下游的调控蛋白主要包括周期蛋白(Cyclins)、周期蛋白依赖性激酶(CDKs)、周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI).Cyclin E及Cyclin B1蛋白分别是细胞周期的关键调控蛋白，分别担任着G1/S期及G2/M关卡检测点的作用，其表达水平的降低直接会导致细胞难以越过关卡，发生周期阻滞现象，进而抑制细胞增殖[16].

为了解淫羊藿素对周期调控蛋白的影响与p53、周期阻滞及凋亡之间的关系，本文检测G1/S及G2/M关卡调控蛋白CyclinE、CyclinB1的蛋白表达水平，进一步探讨淫羊藿素介导不同p53分型顺铂耐药卵巢癌细胞发生周期阻滞所依赖的调控途径.Western blot实验数据显示，淫羊藿素能够促进p53野生型C13*细胞株p53蛋白激活，并伴随CyclinE蛋白表达下调(P<0.05)，提示淫羊藿素可以通过下调CyclinE蛋白使得p53野生型顺铂耐药卵巢癌细胞DNA复制无法通过G1/S关卡，发生G1期的周期阻滞.Du[1]等研究发现，野生型p53卵巢癌细胞能够通过p53途径介导细胞发生G1期阻滞，而p53缺失型的卵巢癌细胞则还可以通过CHK1途径介导细胞发生G2期阻滞.本研究发现，p53变异型A2780cp及p53缺失型SKOV3细胞株的p53并无明显激活(P>0.05)，反而出现CHK1蛋白表达增强，并伴随CyclinB1蛋白下调现象(P<0.05).由此推测，p53变异及缺失型顺铂耐药卵巢癌细胞可通过CHK1途径下调CyclinB1将细胞阻断在G2/M关卡，发生G2期周期阻滞，与流式细胞技术的检测结果一致.

综上，淫羊藿素对于不同p53分型的耐药卵巢癌细胞均能通过不同途径发挥周期阻滞作用，融合其作为补益中药在提高免疫力方面的优势，可以为临床上复发性耐药卵巢癌的治疗提供新思路.