血清LIF、HB-EGF与冻融胚胎移植术后妊娠结局的相关性及对妊娠成功预测价值分析

李娜, 苗聪秀, 李丹, 李敏, 付亚静, 马甜思

(长治医学院附属和平医院 生殖遗传科， 山西 长治 046000； 长治医学院 生殖遗传研究所， 山西 长治 046000)

不孕症是临床常见疾病，随着生活节奏的不断加快及生活环境的转变，不孕症发病率呈逐年升高趋势，给有生育需求的家庭造成严重伤害[1].近年来辅助生殖技术迅猛发展，体外受精-胚胎移植术(in vitro fertilization embryo transfer，IVF-ET)成为治疗不孕症的重要手段之一，而冻融胚胎移植术(frozen thawed embryo transfer，F-ET)是将多余优质胚胎利用冻融技术，增加患者受孕机会的重要手段，目前已广泛用于临床[2].F-ET可有效减少胚胎浪费、增加受孕机会、提高临床妊娠率，但临床调查发现，仍有部分患者多次接受F-ET后妊娠失败[3].因此，寻找影响F-ET术后妊娠结局的危险因素及有效预测妊娠成功的临床指标，对指导F-ET术前干预、提高妊娠成功率有重要临床意义.近年来研究显示，不孕症患者血清白血病抑制因子(LIF)在分泌中期子宫内膜中异常低表达，多囊卵巢综合征导致不孕患者血清中肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)异常表达，推测LIF、HB-EGF是影响受精卵着床、发育的重要因子[4-5].目前关于血清LIF、HB-EGF水平对F-ET术后妊娠结局的相关性及其对妊娠成功的预测价值研究尚少，为此，本研究对92例拟接受F-ET术患者的血清LIF、HB-EGF水平进行检测和分析.

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年3月至2019年12月拟进行F-ET术患者，纳入标准：①女方年龄≤45岁；②夫妻双方染色体检查均无异常；③新鲜胚胎移植术均未成功妊娠；④女性月经周期正常；⑤患者均签署知情同意书.排除标准：①非F-ET手术患者；②未进行干预的输卵管积水患者；③合并严重基础疾病者.

选取符合上述标准的92个周期(92例患者)，女方年龄23～45岁，平均(38.1±4.3)岁；不孕年限1～16年，平均(6.9±1.2)年；体质量指数(21.7±2.7)kg/m2；不孕原因：女方因素47例，男方因素24例，双方因素11例，不明原因6例；子宫内膜准备方案：自然周期44例，人工周期48例；体外受精方式：常规体外受精41例，卵胞浆内单精子注射51例.本研究获得医院伦理委员会批准.

1.2 方法

1.2.1 胚胎冻融及评估

选取常规进行体外受精-胚胎移植术后正常受精来源的胚胎，即第3天(D3)胚胎进行冷冻.倒置显微镜下评估胚胎质量：以卵裂球大小均匀、胞质碎片≤10%为Ⅰ级胚胎；以卵裂球大小比较均匀，胞质碎片≤20%为Ⅱ级胚胎；选取Ⅰ、Ⅱ级优质胚胎作为冷冻标准.采用玻璃化冷冻复苏法进行.

1.2.2 子宫内膜准备及胚胎移植

根据患者月经周期、排卵情况选择自然周期或人工周期；①自然周期：阴道超声监测优势卵泡直径达18 mm、子宫内膜厚度达8 mm，确认自然排卵或予以6 000单位人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导排卵，排卵日注射黄体酮20～60 mg/d，连续注射3d，进行胚胎复苏，复苏2 h后，将2枚优质胚胎置入子宫，移植后继续应用黄体酮20～60 mg/d支持.②人工周期：排卵障碍、月经周期或子宫内膜厚度<8 mm者，常规应用戊酸雌二醇4 mg/d，动态监测子宫内膜厚度达8 mm，再给予肌肉注射黄体酮20～60 mg/d，连续注射4 d，进行胚胎复苏，复苏2 h后，将2枚优质胚胎置入子宫，移植后继续应用黄体酮20～60 mg/d支持.

1.2.3 随访及分组

移植后第14天检测血hCG≥50 IU/L则为生化妊娠，第35天B超或阴道超声检查提示孕囊及心管搏动则为临床妊娠，纳入妊娠组；黄体酮支持至孕12周第35天B超检查未见孕囊，纳入未妊娠组.

1.2.4 血清LIF、HB-EGF水平检测

移植日采集患者血样5 mL，室温静置平衡30 min，3 000 r/min离心5 min(离心半径10 cm)，获得上层待测血清，采用LIF、HB-EGF ELISA检测试剂盒(美国R&D公司)，按照试剂盒说明书操作，酶标仪于450 nm波长处测定待测样品光密度值，根据标准品制作的标准曲线计算样品浓度.

1.2.5 Logistic回归分析赋值

收集可能影响妊娠结局的因素，以BMI、不孕年限、移植日血E2、LH、PLIF、HB-EGF水平为连续变量，以不孕原因(男方因素=0、女方因素=1、双方因素=2、不明原因=3)、子宫内膜准备方案(自然周期=0、人工周期=1)、移植日子宫内膜厚度(>11 mm=0、8～11 mm=1、<8 mm=2)、子宫内膜形态(I型(AB)=0、II(C)型=1)、受精方式(常规体外受精=0、卵胞浆内单精子注射=1)为分类变量，并以上述可能影响因素为自变量，以是否妊娠(妊娠=0、未妊娠=1)为因变量，进行Logistic回归分析.

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 妊娠组与未妊娠组可能影响妊娠结局的因素比较

92个冻融胚胎移植周期，临床妊娠32例，临床妊娠率34.78%；妊娠组与未妊娠组年龄、BMI、不孕年限、E2、LH、P水平、不孕原因、子宫内膜准备方案、受精方式比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；妊娠组与未妊娠组子宫内膜形态、移植日子宫内膜厚度比较，差异有统计学意义(P<0.05，表1).

表1 妊娠组与未妊娠组可能影响妊娠结局的因素比较Table 1 Comparison of factors that may affect pregnancy outcome between pregnant group and non-pregnant group

2.2 妊娠组与未妊娠组移植日血清LIF、HB-EGF水平比较

妊娠组移植日血清LIF、HB-EGF质量浓度高于未妊娠组，差异均有统计学意义(P<0.05,表2).

表2 妊娠组与未妊娠组移植日血清LIF、HB-EGF水平比较

2.3 Logistic回归分析导致妊娠失败的危险因素

经Logistic回归分析，子宫内膜形态、移植日子宫内膜厚度、血清LIF、HB-EGF水平均是导致F-ET术后妊娠失败的危险因素(OR=3.074、2.563、4.437、3.881，P<0.05,表3).

表3 Logistic回归分析导致妊娠失败的危险因素Table 3 Logistic regression analysis of risk factors leading to pregnancy failure

2.4 血清LIF、HB-EGF水平对妊娠成功的预测价值

经ROC曲线分析，血清LIF预测F-ET术后妊娠成功的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为84.38%、76.67%、79.35%、0.760，预测最佳截断点为18.40 pg/mL；血清HB-EGF水平预测的灵敏度、特异度、准确度和AUC分别为78.13%、73.33%、75.00%、0.722，预测最佳截断点为31 505.44 pg/mL(表4，图1).

表4 血清LIF、HB-EGF水平对妊娠成功的预测价值Table 4 Predictive value of serum LIF and HB-EGF levels for pregnancy success

图1 血清LIF、HB-EGF水平对妊娠成功预测的ROC曲线

3 讨论

不孕症原因多种多样，除女性多囊卵巢综合征、输卵管阻塞等因素外，男性因素、遗传因素等也是不孕症常见致病因素，另外约有20%患者不孕原因无法确定[6-7].随着我国辅助生殖技术不断发展，F-ET成为辅助生殖技术的重要补充技术，日趋受到重视.临床研究表明[8-9]，目前F-ET临床妊娠率仍需提高，其中胚胎质量、子宫内膜容受性等多种因素均可影响妊娠结局，寻找可直接或间接影响子宫内膜容受性的因素，对提高妊娠成功率有重要意义.

本研究发现，妊娠组移植日血清LIF、HB-EGF高于未妊娠组；经Logistic回归分析，子宫内膜形态、移植日子宫内膜厚度、血清LIF、HB-EGF水平均是导致F-ET术后妊娠失败的危险因素，提示除子宫内膜形态、移植日子宫内膜厚度外，血清LIF、HB-EGF水平也是导致妊娠失败的危险因素，两者与妊娠结局关系密切.LIF属于分泌型糖蛋白，定位于人11号染色体，具有高度保守型，在哺乳动物体内多种细胞中均可表达，具有调节细胞增殖、分化、诱导肝急性期蛋白等多种生物学活性[10].研究表明，LIF与子宫内膜容受性关系密切，LIF基因敲除鼠可形成正常受精卵，但无法进行着床和发育[11].Modric等[12]研究发现，LIF在猪妊娠早期逐渐增加，在妊娠18 d以后表达量趋于稳定，说明LIF在局部控制滋养层和促进子宫内膜细胞增殖方面起重要作用.HB-EGF是表皮生长因子家族成员之一，具有较强的促细胞分裂作用.研究显示，HB-EGF与其受体结合后，可通过促进黄体成熟、调节性激素等途径，介导胚胎细胞与子宫内膜间的“分子对话”，为受精卵着床、发育提供条件[13-14].Fawzy等[15]研究表明，卵胞浆内单精子注射后添加LIF、HB-EGF细胞因子可有效提高胚胎质量，改善妊娠结局.上述研究与本研究结果共同说明LIF、HB-EGF可能在提高胚胎质量、改善F-ET术后妊娠结局方面具有积极意义，而不孕症患者血清LIF、HB-EGF水平下降，可能通过抑制子宫内膜细胞增殖，减小子宫内膜容受性，不利于受精卵着床，从而使妊娠失败.

本研究经ROC曲线分析，血清LIF、HB-EGF水平预测F-ET术后妊娠成功AUC分别为0.760、0.722，提示两者对F-ET术后妊娠成功有较高预测价值.LIF在胚胎着床中起重要作用，研究显示，LIF存在基因多态性，且不孕症人群LIF基因突变导致的在增殖期低表达，是导致体外受精失败的原因之一[16].既往研究发现，HB-EGF可通过自分泌或旁分泌方式促进子宫内膜蜕膜化，与自身受体结合后促进受精卵着床，或作为生长因子参与胎盘的形成和发育[17].胚胎发育早期，HB-EGF通过促进滋养层细胞迁移、侵袭，提高胚胎存活率，因此，HB-EGF在子宫内膜准备、胚胎着床及发育中起重要作用，但具体机制仍需要进一步研究证实.

综上所述，移植日血清LIF、HB-EGF水平与F-ET术后妊娠结局关系密切，且两者对F-ET术后妊娠成功有较高预测价值.临床中在进行F-ET术前应加强血清LIF、HB-EGF水平的检测，便于早期对临床妊娠结局做出预测，采取及时有效的干预手段提高妊娠成功率.