苯胺衍生化-高效液相色谱法测定L-乙酰氧基丙酰氯中的乙酰氯

(浙江司太立制药股份有限公司,台州 317300)

L-乙酰氧基丙酰氯为无色透明发烟液体,具有强烈的刺激性气味,腐蚀性强,易与水、醇类化合物等快速反应,它是合成非离子型碘造影剂碘帕醇的重要原料之一[1]。乙酰氯是L-乙酰氧基丙酰氯合成过程中的残留物,也是合成L-乙酰氧基丙酰氯的原料[2]。乙酰氯会在碘帕醇合成过程中产生乙酰化物杂质,它很难通过精制工艺去除,因此,必须严格控制L-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯的含量。

由于未检索到与乙酰氯测定相关的文献,考虑到乙酰氯与多氯酰氯相似的化学性质,故可借鉴检测多氯酰氯的方法来检测乙酰氯。一般采用化学法测定多氯酰氯的含量[3],也可采用直接进样-气相色谱法(GC)[4]测定,但在采用直接进样-GC测定多氯酰氯时,易出现进样针、进样口、色谱柱腐蚀及测定值重现性差等问题。因此,有研究者采用酯化-GC[5-7]和衍生化-GC[8-10]测定多氯酰氯的含量。但采用高效液相色谱法(HPLC)测定多氯酰氯含量的报道较少,也未见其在乙酰氯测定方面的应用。

本工作先用苯胺将乙酰氯衍生化,然后采用HPLC测定L-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯的含量,以期为L-乙酰氧基丙酰氯的质量控制提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器(DAD)和Agilent Open Lab CDS 2.2 工作站。

苯胺溶液:0.6%(体积分数),移取苯胺约0.3 mL于50 mL 容量瓶中,用30%(体积分数,下同)甲醇溶液稀释至刻度。

乙酰氯对照品储备溶液:2.40μL·L－1,移取苯胺约0.3 mL于样品瓶中,再加入乙酰氯24μL,充分振摇后超声5 min,加入30%甲醇溶液约1 mL,再超声1 min,转移至100 mL容量瓶中,用30%甲醇溶液稀释至刻度;再分取该溶液1.0 mL,用30%甲醇溶液定容至100 mL。

乙酰氯对照品溶液:0.120μL·L－1,移取乙酰氯对照品储备溶液0.5 mL 于10 mL 容量瓶中,用30%甲醇溶液稀释至刻度。

乙酰氯标准溶液系列:移取0.5,0.5,1.0,1.5,2.0 mL乙酰氯对照品储备溶液,用30%甲醇溶液定容至100,20,20,20,20 mL,配制成0.012,0.060,0.120,0.180,0.240μL·L－1的乙酰氯标准溶液系列。

苯胺为分析纯;甲醇为色谱纯;试验用水为纯水。

L-乙酰氧基丙酰氯供试品批号201707001,由新乡市金升化工有限公司提供;乙酰氯对照品批号20130222。

1.2 仪器工作条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱温30 ℃;流动相为30%甲醇溶液,流量1.0 mL·min－1;检测波长240 nm;进样量20μL。

1.3 试验方法

移取苯胺约0.3 mL 于样品瓶中,加入L-乙酰氧基丙酰氯供试品70μL,充分振摇后常温超声5 min,加入30%甲醇溶液1 mL,再超声1 min,转移至50 mL 容量瓶中,用30%甲醇溶液稀释至刻度;分取该溶液1.0 mL,用30%甲醇溶液定容至10.0 mL,所得溶液即为供试品溶液。按照仪器工作条件测定供试品溶液中乙酰氯的含量。

2 结果与讨论

2.1 衍生条件的选择

苯胺衍生化反应可引入苯环结构,便于后续的紫外检测器检测。经过试验优化,最终确定的衍生化反应条件为常温超声5 min,生成的衍生化产物乙酰苯胺的结构见图1。

图1 乙酰苯胺的结构Fig.1 Structure of acetanilide

由于乙酰苯胺在酸性或碱性溶液中均易分解,故衍生反应结束后,试验通过向反应液中加入近中性的30%甲醇溶液来保证衍生产物的稳定。

2.2 检测波长的选择

由于乙酰苯胺具有紫外吸收峰的苯环结构,采用DAD 在波长190～400 nm 内对其进行了紫外在线扫描,结果见图2。

图2 乙酰苯胺的紫外光谱图Fig.2 UV spectrum of acetanilide

由图2可知:乙酰苯胺在241.3 nm 处有最大紫外吸收。因此,试验选择的检测波长为240 nm。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 色谱柱

试验比较了十八烷基硅胶柱 VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5μm)和ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)对乙酰苯胺的分离效果。结果显示:ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)得到的乙酰苯胺的色谱峰峰形及分离效果较好,因此,试验选择ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)为分离柱。

2.3.2 流动相

试验比较了分别以甲醇溶液和乙腈溶液为流动相时乙酰苯胺的分离效果。结果显示,两种流动相下得到的乙酰苯胺的分离度均大于2.0。由于甲醇溶液作流动相更常用,因此,试验选择甲醇溶液作流动相。

试验还比较了甲醇溶液的体积分数分别为30%和40%时对乙酰苯胺的分离效果。结果显示,前者获得的乙酰苯胺的分离度可以达到2.0以上,故试验选择30%甲醇溶液作为流动相。

2.4 专属性试验

按照仪器工作条件测定苯胺溶液、乙酰氯对照品溶液、加标供试品溶液(由体积比为1∶20乙酰氯对照品储备溶液和供试品溶液混合而成),所得结果见图3。

由图3可知:衍生化后,产生了乙酰苯胺的色谱峰,其与苯胺的分离度在2.0以上;加标供试品溶液中还出现了L-乙酰氧基丙酰苯胺的色谱峰和样品中带来的未知杂质的色谱峰,分离度也均在2.0以上,说明方法的专属性较好。

图3 苯胺溶液、乙酰氯对照品溶液、加标供试品溶液的色谱图Fig.3 Chromatograms of aniline solution,acetyl chloride control solution and spiked test solution

2.5 标准曲线和检出限

取乙酰氯标准溶液系列,按照试验方法对其进行衍生化后,按照仪器工作条件测定,以乙酰氯的体积分数为横坐标,其对应衍生物乙酰苯胺的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,标准曲线的线性范围为0.012～0.240μL·L－1,线性回归方程为y＝121.0x＋0.130 1,相关系数为0.999 4。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),所得结果为0.006μL·L－1。

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法对加标量分别为0.062,0.120,0.180μL·L－1的供试品溶液进行测定,每个加标水平平行测定5次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。结果显示:3种加标水平下的回收率分别为94.8%,94.2%,92.7%,测定值的RSD 分别为5.5%,8.3%,2.9%。

取同一批样品,按照试验方法平行测定6次,所得测定值的RSD 为8.9%。

2.7 样品分析

按试验方法分析供试品,检出乙酰氯在供试品中的体积分数为0.16%。

本工作采用苯胺衍生化-HPLC 测定了L-乙酰氧基丙酰氯中的乙酰氯,本方法衍生化反应快速、回收率高、精密度好,可作为L-乙酰氧基丙酰氯中乙酰氯(杂质)控制的一种可靠的分析方法。