超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中21种抗组胺类药物

吕 稳,李红英,李丽霞,丁晓萍

(1.湖北省药品监督检验研究院,武汉 430075;2.湖北省药品质量检测与控制工程技术研究中心,武汉 430075)

化妆品由于基质复杂、辅料繁多,又与人体皮肤直接接触,常引起过敏反应,其主要过敏原有防腐剂、芳香混合物、重金属、激素、中药提取物等[1-2]。为减轻过敏反应,化妆品中有添加抗过敏药物的风险。组胺是引起人体皮肤过敏反应的主要化学物质,因此抗组胺类药物是目前主要使用的抗敏剂。然而,长期使用抗组胺类药物会引起多种不良反应,如嗜睡、变应性接触性皮炎、心脏毒性等,还会让皮肤对其产生依赖性,停止使用后过敏症状加重,可能引起毛细管扩张、色素沉着、内分泌紊乱等不良反应[3-5]。我国2015年版《化妆品安全技术规范》明确规定地氯雷他定等15种抗组胺类药物为禁止添加物[6]。然而,随着医学水平的不断发展,抗组胺类药物种类远不止15种,如多西拉敏、奥洛他定、曲普利啶、咪唑斯汀、非索非那定和酮替芬等6种常用的抗组胺类药物[7-8]。为了进一步完善相关监督体系,净化化妆品市场,应扩大抗组胺类药物的检测范围。

目前关于抗组胺类药物的检测方法主要有液相色谱法和液相色谱-质谱法[9-13],其检测对象主要为药物、保健食品,而关于化妆品中抗组胺类药物的检测研究较少,且研究对象主要集中在祛痘类、婴幼儿等相关产品上[5,14-15]。面膜类产品因其良好的效果而得到广泛使用,由于其与人体面部敏感皮肤直接接触,且用液量大、接触时间长,所以引起过敏的风险较高,因此有必要对其添加抗过敏类药物的风险进行评估。相对于传统液相色谱法和液相色谱-质谱法,超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)由于具有分析快速、灵敏度高、定性定量准确等优点而得到广泛应用。因此,本工作采用UHPLCMS/MS同时测定化妆品中21种抗组胺类药物(琥珀酸多西拉敏、富马酸酮替芬、盐酸曲吡那敏、马来酸氯苯那敏、盐酸曲普利啶、马来酸溴苯那敏、盐酸奥洛他定、盐酸苯海拉明、阿司咪唑、地氯雷他定、盐酸异丙嗪、盐酸非索非那定、盐酸赛庚啶、盐酸羟嗪、咪唑斯汀、盐酸西替利嗪、盐酸氯丙嗪、奋乃静、特非那定、盐酸氟奋乃静、氯雷他定),同时对50批面膜中21种抗组胺类药物进行筛查,以期为化妆品中违禁使用的抗组胺药物的分析提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters TQD 型超高效液相色谱-串联质谱仪;XP-204型电子天平;HMV-50A 型涡旋振荡器;BRANSON 8800型超声波清洗仪;Milli-Q A10型超纯水器。

单标准储备溶液:分别称取21种抗组胺类药物标准品0.01 g,用甲醇溶解并定容于10 mL 棕色容量瓶中,配制成1.00 g·L－1的单标准储备溶液。

混合标准溶液:移取各目标化合物的单标准储备溶液0.5 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇稀释配制成5.0 mg·L－1的混合标准溶液。

混合标准溶液系列:取混合标准溶液10,20,50,100,200,500μL至10 mL 容量瓶中,用甲醇稀释配制成5,10,25,50,100,250μg·L－1的混合标准溶液系列。

琥珀酸多西拉敏、富马酸酮替芬、盐酸曲吡那敏、马来酸氯苯那敏、盐酸曲普利啶、马来酸溴苯那敏、盐酸奥洛他定、盐酸苯海拉明、阿司咪唑、地氯雷他定、盐酸异丙嗪、盐酸非索非那定、盐酸赛庚啶、盐酸羟嗪、咪唑斯汀、盐酸西替利嗪、盐酸氯丙嗪、奋乃静、特非那定、盐酸氟奋乃静、氯雷他定等21种抗组胺类药物标准品纯度均大于99%;甲醇、甲酸和甲酸铵为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),柱温30 ℃;流量0.4 mL·min－1;流动相:A 为含0.1 mol·L－1甲酸铵的0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B为甲醇;进样量1μL。梯度洗脱程序:0～4 min时,B为50%;4～14 min时,B由50%升至100%,保持2 min;16～16.1 min时,B由100%降至50%,保持4 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源正离子(ESI＋)模式;去溶剂气流量550 L·h－1;去溶剂温度250 ℃;毛细管电压3 000 V;多反应监测(MRM)模式;为提高仪器灵敏度,采用分段采集模式:0～9 min,采集序号1～12的化合物;7～14 min,采集序号13～21的化合物(各序号对应的化合物见表1)。其他质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

称取0.1 g(精确到0.000 1 g)样品于具塞比色管中,加入甲醇20 mL,涡旋振荡30 s,使试样与提取溶剂充分混匀。超声提取20 min,用甲醇定容至25 mL,摇匀,若样品溶液黏度较大,过滤困难,则以8 000 r·min－1转速离心10 min。取样品溶液或上清液过0.22 μm 滤膜,滤液供UHPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件测定阴性样品溶液、混合标准溶液和加标样品溶液(加标量为100μg·L－1),得到的总离子流色谱图见图1。

图1 阴性样品溶液、混合标准溶液和加标样品溶液的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of negative sample solution,mixed standard solution and spiked sample solution

由图1可知:阴性样品溶液的色谱图中基本无杂峰,混合标准溶液和加标样品溶液的色谱图基本一致,表明该方法的干扰较少,特异性较好;21种目标化合物色谱分离较好,峰形尖锐对称,15 min内全部出峰,满足试验分析要求。

2.2 提取溶剂的选择

试验考察了分别以甲醇、乙醇和乙腈等3种有机溶剂作为提取溶剂时的提取效果(以21种目标化合物回收率的平均值表示)。结果显示:以甲醇、乙醇和乙腈作提取溶剂时,所得回收率分别为95.2%,89.7%,94.5%。其中,乙腈和甲醇的回收率相近,考虑到乙腈的毒性较大,试验选择甲醇作为提取溶剂。

2.3 色谱柱的选择

试验比较了Waters Cortecs C18(150 mm×2.1 mm,2.7 μm)、Agilent Poroshell EC-C18(100 mm×2.1 mm,2.7μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH-C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)等3种色谱柱对21种目标化合物分离效果和峰形的影响。结果显示:3种色谱柱的分离效果有所差别,Waters Cortecs C18色谱柱分析时间较长,Agilent Poroshell EC-C18色谱柱的分离度优于Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱的。综合出峰时间、分离度和峰形等因素,试验选择Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)。

2.4 质谱条件的选择

在电喷雾离子源下,对100μg·L－1的21种抗组胺类药物混合标准溶液分别进行正离子和负离子扫描,结果显示,21种目标化合物均在ESI＋模式下获得最佳准分子离子峰。再采用二级质谱扫描模式对准分子峰进行子离子扫描,优化碰撞能量和锥孔电压,选择特征峰明显、丰度较高的两个子离子作为定性定量离子,其中响应值较大且稳定的一个子离子作为定量离子。优化后的质谱条件见表1。

2.5 标准曲线、检出限与测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以各目标化合物的质量浓度为横坐标,其对应的定量离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:21种抗组胺类药物标准曲线的线性范围均为5～250μg·L－1,其他线性参数见表2。

以3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N),以10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N),结果见表2。

由表2 可知:21 种抗组胺类药物的检出限为0.1～0.5μg·L－1,测定下限为0.2～1.5μg·L－1。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法对水基、乳基和霜基等3种基质的阴性样品进行2个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),所得精密度和回收试验结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3 (续)

由表3可知:21种抗组胺类药物在3种基质中的回收率为80.2%～110%,RSD 为1.5%～7.9%,表明本方法具有较好的准确度和精密度,满足化妆品检测的要求。

2.7 稳定性试验

制备阴性加标样品,加标量分别为10,100μg·L－1,分别于0,3,6,9,12,24 h进样测定,计算各目标化合物测定值的RSD。结果显示:21种抗组胺类药物测定值的RSD 均小于4.8%,表明该方法稳定性良好。

2.8 样品分析

按照试验方法分析50 批面膜样品,均未检出21种目标抗组胺类药物,表明所选择的产品质量状况良好。

本工作建立了UHPLC-MS/MS同时测定化妆品中21种抗组胺类药物含量的方法,该方法可以在15 min内实现21种抗组胺类药物的筛查,适用于水、乳和霜类等多种基质样品分析。本方法定性定量准确、操作简单、准确度高、精密度好、检出限低,可以满足化妆品中非法添加抗组胺类药物的多组分快速检测,能为监管化妆品非法添加提供有力的技术支持。