全自动凝胶渗透色谱法净化-气相色谱-串联质谱法测定茄果类蔬菜中7种有机磷类杀虫剂残留量

(广西工业职业技术学院,南宁 530000)

茄果类蔬菜具有易种植、产量高、生长供应季节长、经济利用范围广等特点,且富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素等多种营养成分,在我国南北各省份均有种植。由于茄果类蔬菜喜温暖,故其生长环境有利于病虫害的滋生,且其果实裸露在环境中,极易受到病虫害的影响而导致品质和产量的下降。茄果类蔬菜病虫害主要有炭疽病、疮痂病、青枯病等,种植过程中常施用抑菌灵、毒死蜱、氟菌唑等农药用于病虫害的预防和治疗[1-6],如抑菌灵、噻菌灵、敌菌灵常用于防治炭疽病,百菌清常用于防治疮痂病等[7-8]。人们误食用被农药污染的茄果类蔬菜时,会对人体产生不良的影响,严重时可能导致死亡。因此,加强对茄果类蔬菜中常用农药的检测具有重要的意义[9-11]。

凝胶渗透色谱法(GPC)是利用凝胶孔的空间尺寸效应,使不同尺寸的物质按照一定的洗脱顺序洗脱出来,从而达到分离的目的,是近些年发展起来的用于农药、兽药等残留检测的前处理方法[12-14]。茄果类蔬菜含有大量的维生素、蛋白质、天然色素等营养成分,基质较为复杂,GPC 相比其他方法如固相萃取法等,具有净化效果更好、检测准确度更高等特点。本工作建立了GPC-气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)测定茄果类蔬菜中抑菌灵、毒死蜱、氟菌唑、百菌清、噻菌灵、敌菌灵和戊菌唑等7种常用杀虫剂残留量的方法,试验结果令人满意[15-18]。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津GC-2010型气相色谱-TQ 8040三重四极杆质谱仪;GPC Cleanup 600 型凝胶净化系统;DSY-VI型氮吹仪。

环氧七氯、抑菌灵、毒死蜱、氟菌唑、百菌清、噻菌灵、敌菌灵和戊菌唑标准溶液:100 mg·L－1。

内标溶液:取适量100 mg·L－1的环氧七氯标准溶液,用正己烷作为溶剂,将其稀释配制成10 mg·L－1的内标溶液,备用。

混合标准储备溶液:分别取一定量的100 mg·L－1的抑菌灵、毒死蜱、氟菌唑、百菌清、噻菌灵、敌菌灵和戊菌唑标准溶液,以正己烷为溶剂,稀释配制成质量浓度均为10 mg·L－1的混合标准储备溶液。

乙腈、丙酮、正己烷为色谱纯;氯化钠为分析纯。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 GPC条件

洗脱剂为体积比1∶4 的丙酮-环己烷混合溶液;流量5 mL·min－1;洗脱时间8 min;收集时间6 min。

1.2.2 GC-MS/MS条件

1)GC 条件 HP-5MS 色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);载气为氦气,纯度为99.999%;流量1.6 mL·min－1;进样口温度250℃;进样方式为脉冲不分流进样;进样量1μL。柱升温程序:初始温度为60 ℃,以25 ℃·min－1速率升温至180 ℃,保持2 min;再以15 ℃·min－1速率升温至320 ℃,保持10 min。

2)MS/MS条件 电子轰击(EI)离子源;电离能量70 e V;传输线温度280℃,离子源温度240 ℃;碰撞气为高纯氩气,纯度为99.999%;扫描方式为多反应监测(MRM)模式;溶剂延迟时间2.8 min。其余质谱参数见表1。

表1 7种农药的质谱参数Tab.1 MS parameters of 7 pesticides

1.3 试验方法

1.3.1 样品的预处理

采摘新鲜的茄果类蔬菜样品,切碎,用样品粉碎机均质匀浆后装入洁净的样品袋中,密封并将试样于－18 ℃冷柜中保存备用。称取20 g上述已预处理的茄果类蔬菜样品于100 mL 具塞量筒中,加入10 g氯化钠后,再加入40 mL 乙腈,强力振摇后静置30 min,使有机相与水相充分分离[19]。取上清液20 mL用氮气吹至近干。加入5 mL正己烷溶解残渣,经0.45μm 滤膜过滤后,待凝胶渗透色谱净化。

1.3.2 样品的浓缩和测定

取上述滤液,按GPC 条件进行净化浓缩,将洗脱液氮吹至近干后,加入10 mg·L－1的环氧七氯内标溶液100μL,以正己烷定容至2 mL,摇匀,按GC-MS/MS条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 净化方法的选择

茄果类蔬菜含丰富的维生素、果胶等物质,及类胡萝卜素、多酚(如类黄酮)等多种植物化学物质。茄果类蔬菜基质较为复杂,一般的固相萃取净化方式很难将这些物质去除干净。GPC 可按照复杂样品中所含物质分子体积的大小进行分段收集,有效去除样品中的大分子基质及小分子干扰物质,提高分析的灵敏度与检测结果的准确度。

试验选择丙酮和环己烷的混合溶剂作为洗脱剂,考察两种溶剂的体积比不同时对7种农药回收率的影响。结果发现:以体积比为1∶4的丙酮-环己烷混合溶液为洗脱剂时,7种农药的回收效果最佳。同样,根据7种农药分子体积的大小及色谱图的变化来调整洗脱时间和收集时间。最终确定GPC条件见1.2.1节。

2.2 基质效应的影响

基质效应是指被测物中其他共存成分对目标物测试结果的影响,在农药残留检测中基质效应广泛存在。一般来说,基质不同,对检测信号的响应呈现不同的效应。气相色谱、气相色谱-质谱系统中一般呈现信号增强效应;而液相色谱、液相色谱-质谱系统则较多的呈现信号减弱效应。为保证检测结果的准确度,检测过程中需对基质效应进行基质补偿或消除。目前常用的基质补偿或消除的方法有同位素标记法、基质匹配标准曲线法和加保护剂法。

试验结合同位素标记法和基质匹配标准曲线法,采用内标法(以环氧七氯为内标物)来消除色谱系统进样带来的误差及前处理导致的损失;同时为了模拟茄果类蔬菜样品的真正环境,用空白样品溶液配制系列浓度的基质匹配标准溶液用以绘制标准曲线,来补偿标准溶液中农药的吸附或降解造成的损失。未采用和采用基质补偿的标准色谱图分别见图1(a)和图1(b)。

由图1可见:未采用基质补偿的标准色谱图中,色谱峰响应值较采用基质补偿的色谱峰响应值低,且峰形较差。

图1 基质补偿前后的标准色谱图Fig.1 Chromatograms of standards before and after matrix compensation

表2为采用标准曲线-外标法与基质匹配标准曲线-内标法所得的回收率对比情况。

由表2可以看出:采用基质匹配标准曲线-内标法时,7种农药的回收率均取得满意的结果。

表2 标准曲线-外标法与基质匹配标准曲线-内标法的回收率对比Tab.2 Comparison of recovery obtained by standard curveexternal standard method and matrix matching standard curve-internal standard method%

2.3 质谱条件的优化

首先对GC-MS/MS系统进行系统检漏和自动调谐,确保仪器的灵敏度和分辨率满足测试要求。选择全扫描模式对0.1 mg·L－1的混合标准溶液进行定性测试。对检测数据进行谱图检索,得到抑菌灵、毒死蜱、氟菌唑、百菌清、噻菌灵、敌菌灵和戊菌唑的前体离子和保留时间。选择产物离子扫描模式,通过分组扫描及调节每组结束时间,确保每组扫描通道分配合理。选择丰度比最高的1对离子对作为定量离子对,另外选择2对离子对作为定性离子对。为使质谱条件中灵敏度和分辨率达到最佳状态,自动输入碰撞能量区间,选择MRM 最优程序,自动筛选数据并生成碰撞能量优化曲线,最终确定最佳碰撞能量和离子丰度比,并将此参数作为MRM 样品扫描参数。7 种农药的典型色谱图见图1(b),质谱参数见表1。

2.4 工作曲线和检出限

取空白茄果类蔬菜样品,按试验方法进行处理后得到基质匹配溶液,然后移取适量10 mg·L－1的混合标准储备溶液,加入10 mg·L－1的环氧七氯内标溶液100μL,用正己烷稀释配制成0.05,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0 mg·L－1的基质匹配混合标准溶液系列,待仪器系统稳定后,按仪器工作条件进样分析,记录响应的色谱-质谱图。以各农药的定量离子峰面积和内标物定量离子峰面积的比值为纵坐标,相应的各农药的质量浓度和内标物定量离子质量浓度的比值为横坐标绘制工作曲线。结果显示:7种农药工作曲线的线性范围均为0.05～5.0 mg·L－1,所得线性回归方程和相关系数见表3。

以各农药的定量离子对的3倍信噪比(S/N)计算各农药的检出限(3S/N),所得检出限结果见表3。

表3 7种农药的线性回归方程、相关系数和检出限Tab.3 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

由表3 可知:7 种农药的检出限为0.002 2～0.004 5 mg·kg－1。

2.5 精密度和回收试验

按试验方法对茄果类蔬菜样品(西红柿)进行分析,结果表明,在西红柿样品中7种农药均未检出。

称取20 g已预处理的茄果类蔬菜样品(茄子)于100 mL 具塞量筒中,加入一定量的混合标准溶液,按试验方法处理样品,分别在0.03 mg·kg－1(低)、0.30 mg·kg－1(中)和3.00 mg·kg－1(高)等3个浓度水平下进行加标回收试验。每个样品平行进样6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),以考察方法的准确度和精密度,所得结果见表4。

表4 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表4可知:7种农药在3个浓度水平下的回收率为94.2%～103%,RSD 为2.6%～4.0%,符合分析测试的要求。

本工作采用GPC 结合GC-MS/MS 建立检测茄果类蔬菜中7种有机磷类杀虫剂的分析方法。结果表明,GPC 的净化效果好,自动化程度高;GCMS/MS的定性、定量结果准确,方法学参数如加标回收率、精密度及检出限等均满足农药残留对灵敏度及准确度的要求。方法具有净化效果好、检出限低、回收率和精密度好等优点,可以用于蔬菜中的微量农药残留的检测。