碳点在食品安全检测中的应用

邓 晨,周化岚,梁营芳,王 锋,张建国

(上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093)

碳点(CDs)是一类零维荧光准球形纳米颗粒,其尺寸小于10 nm[1],由XU 等[2]于2004年发现。他们通过电弧放电的方法合成单壁碳纳米管(SWCNTs),然后对其悬浮液进行分离纯化时,发现了一种新型荧光纳米材料可以在波长365 nm 的紫外光下发出不同颜色的荧光,进而CDs的特性、合成方法和应用得到了广泛的研究[3]。荧光CDs的关键特性包括激发光/酸度依赖性、化学稳定性、抗光漂白性以及上转换荧光[3]。与半导体量子点相比,CDs的低毒性和高生物相容性,使其在生物成像和化学生物传感等方面成为半导体量子点的有力竞争者[4]。CDs荧光分析法具有高灵敏度、易操作、低成本和结果输出快速等显著优势,因此,其在食品安全领域具有巨大的应用潜力[5]。本工作重点介绍CDs的荧光性质、合成方法及其在食品分析中的应用,包括其在重金属离子、病原体、农药和兽药残留、食品添加剂、食品中营养成分等方面检测中的最新进展。此外,还讨论了CDs在基础研究和应用方面目前面临的挑战和未来的展望。

1 CDs的荧光性质

1.1 荧光产生机理

荧光发射是CDs的重要光学特性,但是其荧光的产生机理仍然存有争议。目前已经报道了几种机理,包括量子尺寸效应[6-7]、表面缺陷状态[8-9]、分子和类分子状态[10-12]等。量子尺寸效应是指尺寸对电子-空穴对的辐射复合的影响,而表面缺陷状态是指通过氧化形成的表面缺陷[13-14]。最近,分子和类分子状态被证明是CDs荧光的来源,特别是柠檬酸衍生的CDs[12]。许多荧光性质,包括激发光依赖性和酸度依赖性,都可以用这些机制来解释。

1.2 激发光/酸度依赖性

CDs的激发光依赖性可能是由于CDs表面的量子效应和/或不同的表面缺陷引起的[15]。ZHENG 等[16]认为与激发光有关的性质可能与芳香族C＝C及C－OH 和C＝O 等基团的表面缺陷有关。使用柠檬酸铵和乙二胺作为前体合成的CDs具有激发光依赖性。LI等[17]推断CDs的表面缺陷和较窄的尺寸分布可能与其激发光相关的特性有关。还有一些报道中CDs显示出与激发光无关的发射[18-19],这可能归因于其均匀的尺寸和表面状态。CDs的荧光性质也受酸度的影响[20],可能是CDs表面官能团的质子化和去质子化作用的结果[21-23]。近年来,荧光pH 纳米传感器已被广泛地制备[24-25],且酸度在pH 3.5～10.0内与荧光强度呈良好的线性关系[22]。CDs激发光/酸度依赖性不仅在多色成像和pH 感测中起关键作用,而且还有助于其潜在的荧光机制发挥作用[26]。

1.3 化学稳定性和抗光漂白性

在荧光检测应用中,稳定的荧光信号和较长的发射寿命是荧光传感/成像的必要条件。一般而言,CDs可以在水和高盐度溶液中保存较长时间并且维持稳定。在一些研究中,CDs的荧光强度在6 个月[27]甚至1年[28]内基本没有变化。LIU 等[29]制备的CDs在4 mol·L－1NaCl溶液和400μmol·L－1H2O2溶液中都很稳定,很好地说明了CDs的抗氧化性。此外,CDs适用的酸度范围较宽,为pH 3～12[30]。与CDs的化学稳定性相比,其抗光漂白性更为重要,因为许多测定需要长时间的观察。幸运的是,CDs通常表现出极好的抗光漂白性。例如,不同CDs在UV 照射12 h[31]和24 h[32]后,荧光强度仅略有下降。

1.4 上转换荧光

上转换荧光是一种发射波长小于激发波长的反斯托克斯发光现象[33]。大多数报道的CDs和生物组织在紫外光的激发下通常会发出蓝色荧光,这显然妨碍了对生物体进行荧光分析的准确度[34]。上转换荧光特性为避免含有蛋白质或氨基酸的生物或食品基质的自发荧光提供了解决方法。此外,合成具有上转换荧光发射的CDs非常简单,不需要对传统镧系元素掺杂的上转换荧光纳米粒子进行复杂的修饰。

2 CDs的合成

CDs的合成方法大致可分为两类[35]:①自上而下合成法;②自下而上合成法。自上而下合成法主要是通过化学、电化学或物理方法将碳前体分解为纳米级材料的方法,例如电弧放电法、激光烧蚀法、电化学氧化法等。自下而上合成法通常使用小分子作为反应前体,再通过化学合成的方法合成CDs,包括水热合成法、溶剂热法、超声波振荡法和微波消解法。相比于自上而下合成法,自下而上合成法条件更容易控制且碳源丰富,合成的CDs通常具有较高的荧光量子产率(QY),应用更为广泛。基于此,下面将主要介绍几种自下而上合成法。

2.1 水热合成法

在各种化学方法中,水热合成法是一种极有前途的技术,通常是指在高压和最佳温度条件下,在水性溶剂或矿化剂的存在下,发生非均相化学反应,以溶解和重结晶在常规条件下合成相对不可溶的材料的方法[36]。此法合成的纳米粒子具有形状、大小、表面改性和稳定性可控的性质。由于其众多优点,水热合成技术已被许多研究小组广泛用于合成CDs。YAN 等[37]用己二酸(碳源)和柠檬酸三铵(表面钝化剂)进行一锅水热处理,合成了水溶性光致发光CDs。ZHANG 等[38]用L-抗坏血酸作为碳源,并对其进行水热处理,一步合成了高稳定、单分散的荧光CDs。该方法简便易行,可用于大规模工业生产中CDs的合成和分离。

2.2 溶剂热法

溶剂热法是一种通过在有机溶剂中加热有机分子来制备CDs的简单方法。遵循“自下而上”的原则,通过前驱体的聚合和碳化很容易合成CDs[39-40]。实际上,许多有机分子都可通过溶剂热处理来制备CDs[41-43]。例如,WU 等[44]通过维生素C 和乙二醇的溶剂热处理合成了CDs;同时他们还利用四氯化碳(CCl4)和NaNH2成功地合成了CDs[45]。该方法操作简单,但其应用会受到有机溶剂的毒性和较高反应温度的限制。

2.3 超声波振荡法

2011年,LI等[46]在酸性或碱性环境下对葡萄糖进行超声波处理,成功获得了直径小于5 nm、QY为7%的光致发光CDs。这种利用超声波的高能,在酸、碱或氧化剂的存在下将碳材料裂解成纳米粒子(NPs)的方法,被认为是合成CDs的新途径。此合成过程利用高能超声波,避免了复杂的后处理工艺,实现了小尺寸CDs的简便合成。然而,此法需要对反应时间和QY 进行优化。

2.4 微波消解法

在合成CDs的方法中,微波消解法以快速、高效、方便等优点得到了广泛的应用。早在2009年,ZHU 等[47]采用微波消解法在极短的反应时间内就在具有优异光物理性质的碳水化合物中提取了CDs。LIU 等[48]通过微波消解法,用甘油和4,7,10-三氧-1,13-十三烷二胺作为表面钝化剂合成了光致发光CDs,他们认为是由于在CDs表面上引入了氨基(NH2),使QY 达到了12%。在2017年,CHOI等[49]利用微波诱导的热聚酰胺化和碳化作用,将赖氨酸(AB2型聚酰胺化单体,A:－COOH,B:－NH2)热解,得到QY 为23.3%的水溶性CDs,合成可在5 min内完成。该研究表明,前体中的支化点是获得高QY 的CDs的关键因素,为快速制备具有优异性能的CDs提供了新的方向。

3 CDs在食品检测中的应用

目前已有多种先进技术用于食品安全检测,例如气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LCMS)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)[50-53]。这些方法大多数都具有如样品前处理复杂、检测时间长等缺点,特别是要依赖昂贵的仪器和专业人员,这限制了它们在发展中国家,以及设施和专家条件较差的地区的应用。绿色合成的CDs荧光强度高、稳定性和抗光漂白性良好,在荧光传感分析中具有显著优势。利用不同的碳源,结合不同的合成方法,可以控制合成不同性质的CDs。CDs作为一种荧光传感探针,在食品分析检测中有着非常广阔的应用前景。下面将简述CDs在重金属离子、食品添加剂、农药和兽药残留、食品中营养物质、病原体等方面的检测应用,旨在为CDs在食品分析领域的进一步研究提供参考。

3.1 重金属离子检测

一些常见的金属离子如Al3＋、Hg2＋、Cu2＋、Fe3＋等是不可生物降解的,它们通过食物链在人体内积累,会引起各种健康问题。因此,金属离子检测是食品安全监测中必不可少的一环,尤其是有毒重金属离子检测。CDs与金属离子相互作用会导致荧光猝灭,因此常被制作为传感器用于快速、灵敏地检测金属离子。

YANG 等[54]在100 ℃且存在H2O2的条件下将蜂蜜在水中加热2 h合成了CDs,红外光谱显示其表面存在O－H、N－H、C＝N、C＝O、C＝C 和C－O等基团。荧光的最大激发和发射波长被确定为338,420 nm,它们的荧光强度依赖于酸度。合成的CDs在Fe3＋存在下会发生聚集,荧光强度下降。该传感器用于检测Fe3＋,检出限为1.7 nmol·L－1。体系中其他共存离子,包括Hg2＋、Fe2＋、Pb2＋、Ag＋、Ca2＋、Co2＋、Mn2＋、Sr2＋、Zn2＋、K＋、Na＋、Cu2＋,对于Fe3＋的检测无干扰。ZHU 等[55]通过热碳化海带汁的水合成了聚乙烯亚胺(PEI)修饰的CDs,并将其用于酸奶样品中Cu2＋的双信号荧光检测。

Hg2＋对于羧基有很强的亲和力。基于此,HOU 等[56]提出了一种简单且经济的方法,通过柠檬酸钠和尿素的电化学碳化制备了具有良好水溶性的功能化荧光CDs。将QY 为11.9%、平均尺寸为2.4 nm 的CDs作为无标签传感探针选择性检测Hg2＋,检出限低至3.3 nmol·L－1。此外,CDs易于功能化的表面促进了具有特定功能的荧光传感器件的研究和开发,扩展了其在检测领域的实际应用。在痕量重金属离子分析中,基于CDs的传感探针由于其高精度和可靠性逐渐成为有价值的传感器件。

3.2 食品添加剂检测

在食品工业中,食品添加剂对保证食品的色香味、提高食品质量起着重要的作用。然而,合法添加剂(包括着色剂、混凝剂、防腐剂等)的过度使用以及违禁添加剂(包括苏丹红Ⅰ、三聚氰胺、瘦肉精等)的添加,造成了新的食品安全问题,对人类健康构成严重威胁。

3.2.1 合法添加剂

LIN 等[57]以甘油为碳源,PEG 1500为钝化剂,微波辅助合成丝氨酸修饰的CDs。在亚硝酸盐和酸化的H2O2溶液存在下建立了一种亚硝酸盐的定量检测方法。在1.0×10－7～1.0×10－5mol·L－1内,荧光强度随亚硝酸盐浓度增加呈线性增加。在此基础上,该方法成功应用于纯牛奶中亚硝酸盐的检测。YUAN 等[58]采用N-β-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)为碳源合成CDs。合成的CDs能发出强烈的蓝色荧光,而食用色素日落黄能通过荧光共振能量转移选择性猝灭该蓝色荧光,由此开发了一种基于CDs的纳米传感器用于检测日落黄,线性范围为0.3～8.0μmol·L－1,检出限为79.6 nmol·L－1。XU 等[59]利用新鲜芦荟作为前体合成CDs,发现柠檬黄可以通过静态猝灭过程有效地猝灭CDs的荧光。利用这种猝灭现象,研制了检测柠檬黄的荧光探针,线性范围为0.25～32.5μmol·L－1,检出限为73 nmol·L－1。该探针可用于馒头、蜂蜜、糖果等食品样品中痕量柠檬黄的检测。

3.2.2 违禁添加剂

三聚氰胺是氰胺的三聚体,常用于阻燃产品、纺织工业和杀虫剂的生产。由于其成本低、含氮量高,三聚氰胺常被非法掺入牛奶、婴儿配方奶粉和宠物食品中。摄入超过安全限值的三聚氰胺(美国和欧盟的婴儿配方奶粉限值为2.5 mg·kg－1,中国为1.0 mg·kg－1)会导致婴儿肾衰竭甚至死亡。HU等[60]设计了一种Au＠CDs纳米复合材料,可以与智能手机相结合,直观地分析牛奶中的三聚氰胺。该检测方法的检出限较低,为3.6 nmol·L－1,线性范围为1～10 mol·L－1,回收率为102.75%～105.64%。在这种检测系统中,荧光光谱与便携设备的结合,实现了快速、简单、直观的检测,为智能检测的发展提供了新的方向。

苏丹红Ⅰ是一种致癌物,由于其诱人的红色和低成本而被广泛用作食品添加剂,尤其是在辣椒粉中。SU 等[61]以香烟过滤嘴为碳源,通过简单、低成本、绿色的水热合成法成功地合成了QY 为14%的CDs。HU 等[62]以再利用废橡胶轮胎作为低成本碳源合成高价值的荧光CDs,在水热条件下,利用过硫酸铵氧化轮胎并提供氮原子供掺杂,得到QY 高达23.8%的CDs。他们都是利用苏丹红Ⅰ猝灭CDs荧光的原理实现对苏丹红Ⅰ的快速、灵敏检测。YANG 等[63]为了实现对番茄酱中的苏丹红Ⅰ的检测,成功制备了硫掺杂的CDs,且在pH 5.0以内具有良好的稳定性。该传感器检测苏丹红Ⅰ的线性范围为40μmol·L－1以内,检出限为0.12μmol·L－1。

3.3 农药和兽药残留检测

食物中残留的农药和兽药,包括在食物中积累的药物原型及其代谢物,都对人类健康有潜在的危害[64]。对这些残留物的有效分析是食品安全研究中的一个重要课题。新兴的CDs材料可以提供更准确、高效、经济的荧光传感材料,近年来,其在食品中农药和兽药残留检测方面取得了很大进展。

具有特异识别功能的分子印迹聚合物(MIPs)常用于复杂基质的纯化和食品中农药、兽药微量靶分子的富集分离。新兴的嵌入CDs的MIPs为检测食品中的小分子有害物质提供了非常有意义的思路。ZHANG 等[65]设计了一种含有MIPs的室温离子液体(RTIL)敏化的CDs传感探针(RTIL-SCDs-MIPs),用于检测蔬菜和茶叶样品中的杀虫剂氯氟菊酯,检出限为0.5μg·kg－1。CHANG 等[66]利用碳基纳米颗粒作为传感受体开发了一种用于检测对氧磷的单镜头光学生物传感器,结果发现:CDs的强黄色荧光猝灭程度与对氧磷的浓度有关;检出限为(0.22±0.02)μmol·L－1。FU 等[67]构建了一种基于CDs和Fe3＋的复合荧光传感器,该传感器对矿泉水、牛奶和猪肉样品中的氨苄西林有良好的响应,检出限为0.7μmol·L－1。此研究的优点是CDs表面官能团还可为Fe3＋提供结合位点,为该传感器在多个目标物的检测中的应用提供了更可行且有前景的方法。与基于核壳聚吡咯-Cd TeQDs-MIP 的纳米光学传感器[68]相比,基于CDs/Fe3＋的传感器不需要复杂的合成过程和较长的反应时间。重要的是,使用CDs可减少基于重金属的QDs在实际应用中的潜在毒性。

随着荧光免疫传感器的发展,CDs有望成为一种替代性的绿色荧光试剂[69],它的出现为实现经济、方便的免疫分析提供了新的思路。MIAO 等[70]报道了带有蓝色荧光的CDs的合成及其作为传感探针在3种四环素类抗生素视觉识别和定量检测中的应用。在这项研究中,四环素(TC)、土霉素(OTC)和氯四环素(CTC)的检出限分别为5.18,6.06,14.00 nmol·L－1,均低于之前报道[71]中的结果。基于CDs的检测条带上3种四环素类抗生素靶标的荧光信号差异明显,可直观区分,因此可以同时灵敏地检测一个样品中的多个目标物。

3.4 营养成分检测

食品中营养成分可以为人体提供足够的能量和营养,如蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质等,都是正常生命活动所必需的。因此,检测食品中的营养成分是非常必要的。在食品分析领域,CDs已作为传感探针用于检测和分析食物的功能成分,如蛋白质、维生素、酚类化合物等,这是因为其不仅具有良好的光学性质,还具有显著的环保优势、价格低、方便和快速等特点。

谷胱甘肽(GSH)作为氧化还原缓冲液,可以维持生物体内的细胞氧化还原平衡,广泛存在于动物、植物和微生物中[72]。XU 等[73]通过“开启”策略开发了一种荧光探针,用于检测食品中的GSH。他们将柠檬酸钠与尿素混合,水热合成法制备CDs,并通过Hg2＋电子转移对CDs 的荧光进行猝灭。在GSH 存在下,荧光传感器切换到“开”状态,这是由于GSH 与CDs的官能团竞争性结合Hg2＋所致。该荧光传感器成功地应用于各种食品样品中GSH的测定,回收率高,检出限为37 nmol·L－1。此外,还有报道用毒性较低的Cu2＋替代Hg2＋,从而实现对食品中GSH 的高效检测[74]。

卵清蛋白(OVA)含量被作为评价蛋白质质量的参考。FU 等[75]通过一步水热合成法合成了一种新型的N、O、P 共掺杂CDs(NOP-CDs),并应用于鸡蛋制品中OVA 的定量检测。在由NOP-CDs、氧化石墨烯和OVA 抗体组成的荧光共振能量转移系统中,“开-关”传感探针基于抗原-抗体的特异性相互作用,实现了对OVA 的选择性识别和捕获,检出限为153μg·L－1。PURBIA 等[76]开发了绿色和蓝色荧光的高发光效率CDs(尺寸:1～6 nm),用于检测维生素B1,检出限为280 nmol·L－1。该荧光传感器的原理是CDs的荧光可以被Cu2＋猝灭,在加入硫胺素后由于形成可溶性的铜-硫胺素络合物而重新恢复,从而实现对目标成分的快速检测。

植物源性食品中的某些小分子物质具有特殊的抗菌、消炎或抗氧化特性,从而使食品具有特殊的药用特性。这些小分子被定义为“功能成分”,这种食品被称为“药食同源食品”[77-78]。对药食同源食品中功能成分的定性或定量分析是评价其质量的主要方法。荧光CDs为这类功效成分的分析检测提供了一种有效、方便、准确的方法。YANG 等[79]通过苹果酸和尿素水热处理合成了水溶性CDs(直径为2.1 nm,QY 为16.5%),用于金银花中绿原酸的荧光检测。当绿原酸浓度在0.15～60 mol·L－1内增加时,CDs 的荧光可被有效猝灭,检出限为45 nmol·L－1。与使用HPLC 和HPLC-串联质谱法(MS/MS)检测绿原酸的结果进行比较[80-81],所开发的基于CDs的检测方法不仅灵敏度有提升,而且检测速率明显提高,适用于大量金银花样品的快速筛选。

3.5 病原体检测

近年来,由食源性疾病引起的食品安全事故在世界各地屡屡发生。常见的食源性病原体有沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌等,是引起食源性疾病的主要原因[82-83]。

WENG 等[84]使用一步加热法以固体柠檬酸铵和甘露糖(Man)合成了Man修饰的荧光CDs(Man-CDs),并将其成功地应用于大肠杆菌的标记。甘露糖与大肠杆菌凝集素的选择性结合使Man-CDs与大肠杆菌特异性结合,实现了对实际样本(自来水、苹果汁)中低浓度水平(103 CFU/m L)的大肠杆菌的定量检测。需要注意的是,病原体的适当配体是构建用于检测食源性病原体的基于CDs探针的关键组件之一。有效的配体应能够与CDs紧密结合,同时确保与靶标结合时CDs的化学和光学性质的稳定性。阿米卡星是一种众所周知的氨基糖苷类抗生素,可用作大肠杆菌的结合配体。CHANDRA等[85]报道了一步法合成阿米卡星修饰的CDs(CDs-阿米卡星)用于大肠杆菌的测定。该方法的线性范围为7.625×102～3.904×105CFU/m L,检出限为522 CFU/m L。此外,它已成功应用于各种果汁样品(苹果汁、菠萝汁和橙汁)中的大肠杆菌检测。WANG 等[86]构建了CDs-适配体络合物(CDs-apt),用于蛋壳溶液和自来水中鼠伤寒沙门氏菌的定量检测,且不受大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌的干扰,检测范围为1.0×103～1.0×105CFU/m L,检出限为50 CFU/m L。

4 结论与展望

CDs作为一种新型的碳基纳米材料,具有优良的荧光性、良好的生物相容性、低毒性和较低的制造成本等特点,引起了越来越多研究人员的兴趣,并成为研究热点。相关文献已从合成、功能化到应用等方面对CDs进行了深入研究,并取得了一定的进展。然而,CDs的发展及其应用,特别是在食品分析方面,仍处于初步研究阶段,有以下问题有待解决:①虽然目前CDs的类型趋于多样化,但与半导体量子点相比,各CDs的荧光QY 仍较低,其发光或荧光机理的解释仍需深入研究;②食物基质的复杂性在一定程度上限制了基于CDs的检测的特异性和敏感性;现有的方法大多是针对单一目标物的,对于同一样本中同时检测多个目标物的研究较少。因此,通过选择合适的碳源和优化合成工艺,若能提高CDs的QY、化学稳定性和再现性,将为CDs的产业化做出巨大贡献。此外,掺杂或表面功能化CDs结合免疫分析、电化学传感器、MIPs等方法,将进一步拓宽应用范围,提高方法的灵敏度、准确度和特异性。随着免疫分析方法和传感器技术在食品安全领域的不断发展和应用,CDs与免疫分析方法和传感器技术的结合有望为食品安全监管提供一个有前景的平台。