罗丹明6G 衍生物-谷胱甘肽荧光探针测定水中Hg2＋

赵秋媛,杨剑华,王 蕊,张丽珠,杨 敏,张艳丽,王红斌,谭 伟∗

(云南民族大学1.化学与环境学院;2.民族医药学院,昆明 650500)

汞是一种有毒的非放射性重金属元素,对环境的污染比较严重,尤其是水环境污染[1]。汞在自然界中广泛存在,它会通过反应转化为毒性更强的甲基汞[2],一旦经食物链进入人体后便无法排出,产生累积性汞中毒[3-4],从而引发多种疾病甚至死亡。水中汞主要以Hg2＋形式存在,因此建立一种快速、灵敏、方便地测定水中Hg2＋的方法具有重要的实用价值[5-6]。

Hg2＋的传统测定方法主要有原子吸收光谱法和电感耦合等离子体原子发射光谱法,但这些方法存在样品前处理步骤复杂、分析成本昂贵等问题。与传统方法相比,荧光探针法具有操作简便、设备要求不高、可进行实时原位检测、灵敏度高、选择性强等优点,已应用于多种金属离子的测定[7-9]。罗丹明染料具有荧光量子产率高、稳定性好、激发波长和发射波长均处于可见光区以及可形成荧光团“开-关”环等特点,已被用于金属离子荧光探针的制备、小分子(如硫醇)测定、单分子成像等研究领域[10-11]。

基于文献[12],本工作发现荧光探针罗丹明6G衍生物-谷胱甘肽(Rh6G2-GSH)在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)-甲醇缓冲溶液中对Hg2＋具有特异性识别作用,并可产生荧光强度和吸光度的变化,据此建立了荧光分光光度法和紫外-可见分光光度法测定水中Hg2＋含量的方法,以期为水中Hg2＋的测定提供思路。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

5J1-004F-7000型荧光分光光度计;UV 2100型紫外-可见分光光度计;EF 20型pH 酸度计。

Hg2＋标准储备溶液:0.1 mol·L－1,称取适量氯化汞,用水溶解和稀释,配制成浓度为0.1 mol·L－1的标准储备溶液,其他所需浓度均由此溶液用水逐级稀释制得。

GSH 为生物纯;罗丹明6G、HEPES均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 荧光分光光度法

激发波长510 nm;激发狭缝宽度2.5 nm;扫描范围520～700 nm;发射波长555 nm。

1.2.2 紫外-可见分光光度法

电压400 V;扫描范围200～800 nm;检测波长528 nm。

1.3 试验方法

按文献[12]报道的方法合成Rh6G2。在50 mmol·L－1HEPES溶液中加入等体积甲醇,配成HEPES-甲醇缓冲溶液(pH 7)。在反应瓶中加入2 mL 上述缓冲溶液,再加入1×10－4mol·L－1GSH 溶液3 mL 和1×10－4mol·L－1Rh6G2溶液3 mL,在室温下自组装反应2 h。

取30μL 经0.2 mm 滤膜过滤后的水样,加入上述Rh6G2-GSH 溶液4 mL,分别按照两种仪器工作条件进行测试。

2 结果与讨论

2.1 体系酸度的选择

考察了Rh6G2-GSH 体系的pH 分别为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12时对加入Hg2＋前后荧光强度及吸光度的影响,结果见图1。

由图1可知:在不加Hg2＋时,在pH 5～12内,荧光强度和吸光度较低且没有明显变化;在pH 1～5内,Rh6G2-GSH 体系的荧光强度和吸光度均随酸度的增加而增加,这是由于荧光探针Rh6G2-GSH中的螺酰胺环可在酸性条件下打开,使荧光强度和吸光度增大;在加入Hg2＋后,荧光强度和吸光度均显著增强,且在pH 1～12 范围内基本稳定,说明Hg2＋能够增强Rh6G2-GSH 体系的荧光强度和吸光度,且生成的产物不受体系酸度的影响。综合考虑,试验选择的体系酸度为pH 7。

图1 酸度对加入Hg2＋前后荧光强度及吸光度的影响Fig.1 Effect of acidity on fluorescence intensity and absorbance before and after adding Hg2＋

2.2 荧光探针Rh6G2-GSH 对Hg2＋的选择性

在Rh6G2-GSH 体系中加入0.1 mol·L－1的Hg2＋以及同等浓度的Al3＋、Cd2＋、Co2＋、Cr3＋、Fe3＋、Cu2＋、K＋、Mn2＋、Na＋、Fe2＋、Mg2＋、Ca2＋、Zn2＋、Ag＋等常见金属阳离子和空白(水),反应24 h后,所得体系的荧光发射光谱和紫外-可见吸收光谱见图2。

由图2可知:Rh6G2-GSH 体系仅对Hg2＋有较强的荧光强度和吸光度,对其他14种金属阳离子的响应都较弱,表明探针对Hg2＋具有较高的选择性。

图2 Rh6G2-GSH 体系对不同金属阳离子和空白的响应结果Fig.2 Response of Rh6G2-GSH system to the different metal cations and blank

为了进一步探究荧光探针Rh6G2-GSH 对Hg2＋的选择性,在Rh6G2-GSH 体系中分别加入0.1 mol·L－1上述金属阳离子溶液后,再加入0.1 mol·L－1Hg2＋,体系的荧光强度和吸光度变化见图3。

由图3可知:除了Cr3＋外,其他金属阳离子对Hg2＋的荧光检测结果均没有干扰;除Cr3＋、Al3＋外,其他金属阳离子基本对Hg2＋的紫外检测结果没有干扰。造成以上异常现象的主要原因是Cr3＋和Al3＋为易水解离子,会引起体系酸度的改变[13],但当样品溶液中存在Al3＋时,可采用荧光分光光度法进行测定,样品溶液中存在Cr3＋时,应采用适当方法掩蔽或去除Cr3＋后,再采用荧光分光光度法进行测定。

2.3 标准曲线和检出限

按照试验方法测定标准溶液系列,以Hg2＋浓度为横坐标,其对应的荧光强度或吸光度为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:两种方法的标准曲线的线性范围分别为2.5×10－5～2.5×10－4mol·L－1和5.0×10－5～2.5×10－4mol·L－1,线性回归方程分别为y＝1.014×106x－19.69 和y＝3.830×103x－0.140 4,相关系数分别为0.996 5,0.998 8。根据文献[14-15],分别计算两种方法的检出限,所得结果分别为1.39×10－9mol·L－1和4.07×10－7mol·L－1。与荧光分光光度法相比,紫外-可见分光光度法的灵敏度较低,线性范围也较窄,但是这种方法具有操作简便、肉眼可视化等优点,可作为荧光分光光度法的辅助方法。

将本工作中的荧光分光光度法的线性范围、检出限同文献报道的相关方法进行比对,结果见表1。其中TFP5、L1、GSNO＠Au NS、Phenanthroline和R6GHA 分别对应荧光素硫代酰肼探针、罗丹明B衍生物荧光探针、金纳米团簇荧光探针、菲啰啉类化合物探针和罗丹明6G 荧光探针。

由表1可以看出:和其他方法相比,本法的检出限更低,线性范围更宽。

表1 本方法和文献方法的比对Tab.1 Comparison of this method and other methods reported in references

2.4 样品分析

按照试验方法分析水样,未检出Hg2＋。对水样进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定5次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),所得结果见表2。

由表2可知:荧光分光光度法所得的Hg2＋回收率为95.1%～120%,RSD 为0.46%～2.4%;紫外-可见分光光度法所得的回收率为94.8%～100%,RSD 为0.15%～3.4%。两种方法的准确度和精密度均较好,可用于实际水样中Hg2＋的检测。

表2 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

2.5 荧光检测机理的探究

Hg2＋能促进罗丹明6G 衍生物螺酰胺环的开环,与水反应后,生成的水解产物使体系的荧光增强[19]。为了探究Rh6G2-GSH 和Hg2＋识别过程的可逆性,在Rh6G2-GSH 与Hg2＋体系中加入过量的乙二胺四乙酸(EDTA)用于络合Hg2＋,结果显示:加入络合剂后,体系的荧光强度没有明显变化,表明Rh6G2-GSH 和Hg2＋的识别过程不可逆。用四极杆-飞行时间质谱仪解析Rh6G2-GSH 与Hg2＋的反应产物,所得结果见图4。其中图4(b)为该产物的结构及其相关信息。

图4 Rh6G2-GSH 与Hg2＋的反应产物的质谱图Fig.4 MS spectra of the reaction product of Rh6G2-GSH and Hg2＋

由图4 可知:[M ＋H]＋的m/z理论值为415.20,观测值为415.201 3,综合判断,认为该产物为C26H27N2O3＋,推测此识别过程与水解有关,推断反应机理如图5所示。

本工作基于Hg2＋对荧光探针Rh6G2-GSH 的荧光增强作用,采用荧光分光光度法和紫外-可见分光光度法测定了水中Hg2＋的含量。结果显示:Rh6G2-GSH 和Hg2＋发生了不可逆作用,并水解生成了荧光性能更稳定的C26H27N2O3＋;这两种方法的精密度和准确度均较好,荧光分光光度法的检出限更低、线性范围更宽,受其他金属阳离子干扰程度更小,而紫外-可见分光光度法操作简单,能进行肉眼可视化检测,可作为荧光分光光度法的辅助方法,均可用于实际水样中Hg2＋的测定。