鸢尾属植物花器官总RNA不同提取方法的比较分析

罗梦瑶，王有国*，马璐琳

(1. 云南农业大学园林园艺学院, 云南 昆明 650201; 2.云南省农业科学院花卉研究所/ 云南省花卉育种重点实验室/ 国家观赏园艺工程技术研究中心, 云南 昆明 650205)

【研究意义】鸢尾属(IrisL.)植物花姿奇特，花色丰富艳丽，栽培历史久远，为世界著名观赏植物[1-2]。全世界鸢尾属植物约有 300 余种, 生长气候以北温带为主，分布区域集中在亚洲、欧洲及北美洲。中国是鸢尾属植物的分布中心之一，已知的鸢尾属植物有64个种，13个变种，1个亚种和6个变型，主要分布于西南、西北和东北[3]。鸢尾(I.tectorumMaxim.)和西南鸢尾(I.bulleyanaDykes)都为鸢尾属多年生草本植物，云南是鸢尾和西南鸢尾的主要分布地区之一。鸢尾在中国分布范围相对较广，主产地为四川、重庆、贵州、云南和广西等地。鸢尾花冠大，花色蓝紫色，花期较长，在生态园林上有着广泛的应用前景，此外，其根茎“川射干”常用来药用[2, 4]；西南鸢尾主要分布于中国西藏、四川、云南等地在海拔2300 ～ 3500 m的灌木林缘及水边湿地上，花色蓝色至蓝紫色，外花被具蓝紫色的斑点及条纹[5]。西南鸢尾花形美观，具有很高的观赏价值。可成片种植于园林绿地中，也可以与其它植物搭配，丰富群落层次，增强景观效果。【前人研究进展】目前关于鸢尾属植物的研究主要集中在系统分类、栽培应用、种子萌发、化学成分鉴定及细胞学研究等领域[4, 6-10]，而关于鸢尾属植物分子生物学方面的研究较少，仅见少量鸢尾属植物遗传多样性分子标记[11-12]，以及鸢尾花色合成等相关基因的筛选克隆[13-16]等方面的研究。【本研究切入点】纯度好、浓度高的植物总RNA是进行植物目标基因克隆、表达及调控等研究工作的前提和基础[17]。不同的植物因其组织成分、内含化学物质等的不同，适用的RNA提取方法也有很大的差别[18]，植物的花器官组织常因含有较多的多糖、酚类、色素等物质，而影响花朵总RNA的提取质量和得率[19-20]。多糖类物质与RNA很难分离[21]，酚类物质容易被氧化后同RNA结合[22]，传统的使用三氯甲烷的抽提方式很难除去色素[23]，且植物材料的保鲜程度也会影响RNA的提取。另外，RNA结构十分不稳定，容易降解。因此，成功提取出品质优良的RNA至关重要。【拟解决的关键问题】 采用Trizol 法、EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法和TransZol Plant试剂盒法3种方法提取鸢尾植物花朵RNA，并对RNA的质量、产量以及试剂费用等进行对比分析，以期找出提取新鲜及冷冻的鸢尾植物花器官组织总RNA的最适方法，为后续鸢尾属植物分子研究工作奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

冷冻的西南鸢尾花蕾组织于2018年6月29日采自云南省迪庆州香格里拉县城郊外，于液氮中处理后-80 ℃冰箱保存。新鲜的鸢尾花蕾于2019年3月6日采自云南省农业科学院绿化景观带。上述供试植物材料均由云南省农业科学院花卉研究所供给。

1.2 试验试剂

Trizol Reagent购于Invitrogen(美国)公司；EasyPure Plant RNA Kit试剂盒和TransZol Plant试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；水饱和酚、三氯甲烷、异戊醇，异丙醇，无水乙醇，琼脂糖，4×TBE缓冲液、RNase-free水、DEPC(Diethypyrocarbonate, 焦碳酸二乙酯)等均购于昆明云科生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

台式冷冻离心机、NanoDrop 2000超微量分光光度计购于美国Thermo Scientific公司；涡旋振荡器购于上海利闻科学仪器有限公司；压力蒸汽灭菌器购于上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；电子天秤购于德国Sartorius公司；电泳仪、凝胶成像系统购于美国Bio-Rad公司；超纯水机购于南京赛飞生物科技有限公司；制冰机购于深圳市伊雪商用制冷设备有限公司。

1.4 RNA提取

Trizol 法、EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法和TransZol Plant试剂盒法均分别参照各试剂(盒)附带说明书进行操作。RNA提取所用的研钵、镊子、量筒、三角瓶等凡是接触RNA的非一次性器材和工具皆用0.1的DEPC水37 ℃过夜处理后高压灭菌并烘干使用，离心管、枪头等一次性耗材全部选用专用于RNA试验的耗材。RNA的溶解、稀释及75 %乙醇的配制均使用RNase-free水。

1.5 RNA纯度及浓度检测

通过超微量分光光度计对采用Trizol法、EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法和TransZol Plant试剂盒法3种方法分别提取得到的鸢尾植物花蕾组织总RNA的浓度及纯度进行检测(检测前先以RNase-free水作空白对照进行调零)，并记录各RNA样品的浓度，以及所对应的OD260/OD280的比值和OD260/OD230的比值。

1.6 RNA完整性检测

各取2 μl提取得到的RNA样品，加入1.5 μl的2×RNA Loading Buffer混匀后，在80 ～ 100 V电压条件下，经1.0 %的琼脂糖凝胶电泳30 min。电泳结束，通过凝胶成像系统检查RNA的完整性。

2 结果与分析

2.1 总RNA纯度及浓度比较

品质优良的RNA，其OD260/OD280的比值应为1.8 ～ 2.1，OD260/OD230的比值应当大于2.0[24]。当其OD260/OD280所得出的数据小于1.8时，意味着提取的RNA中含有较多的污染。这种污染可能来自于蛋白质或其它的有机物。当其OD260/OD280的数据大于2.2时，说明RNA已经部分降解[25]。若其OD260/OD230数据小于2.0，则说明提取的RNA中也有污染[26]，这种污染可能来自蛋白质、盐类或次生代谢物。

由表1可知，对于冷冻的西南鸢尾花蕾组织，仅TransZol Plant 试剂盒法提取的RNA基本符合要求，但RNA中依然含有盐类、蛋白质等杂质。Trizol 法和EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法提取的RNA，OD260/OD280、OD260/OD230值都很低，蛋白质和盐分残留多，不适于冷冻的西南鸢尾花蕾组织 RNA 的提取；对于新鲜的鸢尾花蕾，供试的3种方法提取出的总RNA的OD260/OD230值均小于2.0，表明存在一定杂质，但其OD260/OD280的比值都在1. 7～2. 2，表明3种方法获得的RNA结构都较为完整，并未明显降解。在RNA的纯度上，3种提取方法高低排序依次为EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法>Trizol法>TransZol Plant试剂盒法，RNA的浓度上，依次为TransZol Plant试剂盒法>EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法>Trizol法。

表1 3种方法提取的冷冻西南鸢尾和新鲜鸢尾的花蕾组织总RNA质量浓度和纯度对比Table 1 Comparison of RNA concentration and purity of fresh I. tectorum Maxim.buds and frozen I. bulleyana Dykes buds extracted by three different methods

2.2 RNA 完整性比较

3种不同方法(试剂)提取出的新鲜鸢尾花蕾的RNA 各取2 μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果均能跑出条带，且较为清晰，亮度较高(图1)。Trizol法和TransZol Plant试剂盒法提取的RNA样品，点样孔显示明亮残余物质(图1)，说明仍有蛋白质残留。3种方法所提的RNA条带均有弥散征象，有明显的拖尾现象，说明RNA在提取过程当中存在一定的降解。

冷冻的西南鸢尾花蕾RNA样品琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，TransZol Plant 试剂盒法提取的RNA样品在电泳时有条带出现(图2,TZ1～TZ8)，而Trizol法和EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法提取的RNA样品在电泳时无条带出现(图2,T1～T4,EP1～EP4)。TransZol Plant试剂盒法提取出的RNA，点样孔偶有亮点(图2,TZ1、TZ4、TZ6、TZ7)，意味着该法也未能将蛋白质等杂质完全去除，但相较于其它2种方法，TransZol Plant 试剂盒法提取的RNA条带清楚、亮度高，结果较好。

2.3 3种总RNA提取方法的优缺点比较

由表2可见，对于新鲜的鸢尾花蕾，EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法提取的 RNA 纯度和浓度均较高，能够满足后续分子生物学试验的需求，且操作耗时较短，但提取试剂价格3者中最高。Trizol法提取的RNA的纯度比较高，但获得的RNA产量低，提取操作费时，试剂价钱也较贵，不推荐选用。TransZol Plant试剂盒法提取的RNA，其纯度较低，但产量很高，操作简便快捷，且价钱较低。可结合要求，在需要很高纯度的RNA时选用EasyPure Plant RNA Kit试剂盒，基本满足后续试验即可但RNA的需求量较大时则选用TransZol Plant试剂盒。对冷冻的西南鸢尾花蕾组织，使用TransZol Plant试剂盒提取的RNA浓度高，品质较好，就能满足后续试验的需求，且操作耗时短，价格较低，可优先推荐使用；而用 Trizol 法和EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法提取 RNA的浓度和纯度均不理想，不适合用于后续实验，且操作时间较长，费用较高，不宜推荐使用。

表2 3种总RNA方法提取方法优缺点比较Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of RNA extracted by three methods

3 讨 论

用Trizol搭配三氯甲烷、水饱和酚(酸性)、异戊醇、异丙醇等试剂使用，从液氮研磨过的植物材料中提取RNA的方法，在现阶段最为常用[28]。但本研究结果显示，无论对于冷冻的还是新鲜的鸢尾植物花蕾组织，Trizol 法提取得到的RNA的效果都不是很理想，究其原因，可能与鸢尾属植物花蕾中含有的较多的多糖、酚类及色素等物质有关，这些物质在RNA的提取过程中会产生干扰，而Trizol 法无法完全阻止它们的干扰作用[27]。加之Trizol试剂价格较高，操作复杂费时，因此不宜用于鸢尾植物花器官组织RNA的提取。

TransZol Plant试剂盒法能够成功提取RNA，所依据原理是改良过的CTAB(Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide, 十六烷基三甲基溴化铵)法[29]。试剂内含有能够结合酚类物质的PVP(Polyvinylpyrrolidone, 聚乙烯基吡咯烷酮)和防止酚类物质氧化的β-巯基乙醇，二者均可在一定程度上减弱酚类物质对RNA提取的影响[24]。提取过程中搭配三氯甲烷、异戊醇等试剂，并联合离心操作可以很好的去除蛋白质和脂肪。因此，应用TransZol Plant试剂盒法提取出的RNA，其产量和纯度一般都较高。本试验结果显示：在3种方法中，尽管TransZol Plant试剂盒法提取出的RNA纯度并不是最好的(对于新鲜的鸢尾花蕾材料而言)，且无法完全避免杂质的污染，但即使是冷冻的植物材料对RNA的提取影响也不大，得到的RNA的产量和品质也相对较稳定。另外，应用该试剂盒提取RNA耗时较短，且试剂盒价格较低，比较经济实用。对需要大量RNA但对RNA的质量要求不是很高的试验可采用此法。

EasyPure Plant RNA Kit试剂盒采取柱式纯化的方法完成RNA的提取，操作步骤比较简捷。根据本试验研究结果，EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法较适用于新鲜植物花器官组织总RNA的提取，而不适用于冷冻留存的植物材料。因其价格较高，在需要高质量的RNA且可获得新鲜的植物材料时可考虑使用。

4 结 论

根据植物材料类型(新鲜或冷冻)、对RNA 纯度和产量的要求、试剂费用及操作过程繁简程度等综合因素考虑，TransZol Plant 试剂盒法更适合在需要大量RNA但对RNA的质量要求不是很高时使用，且对于新鲜、冷冻的鸢尾植物花朵都较适合；EasyPure Plant RNA Kit试剂盒法适合于需求高质量的RNA且有新鲜的植物材料时使用；Trizol法则不太适用于鸢尾花蕾RNA的提取。本研究结果为鸢尾属植物后续的分子生物学研究工作提供一定前期基础，也为其它植物花朵总RNA的提取提供参考。