内生真菌对低磷胁迫下杉木酸性磷酸酶活性的影响

艾如波，徐彩瑶，吴承祯,4，洪 伟，李 键，洪 滔，谢安强*

(1.福建农林大学 林学院，福建 福州 350002；2.福建省高校森林生态系统经营与过程重点实验室，福建 福州 350002；3.南京大学 地理与海洋科学学院，江苏 南京 210023；4.武夷学院，福建 南平 354300)

【研究意义】磷作为植物生长发育的必需元素之一，在人类赖以生存的生态系统中起着不可替代的作用[1]。相关研究指出，在大多数土壤中，由于Ca、Fe和Al化合物以及粘粒的大量存在，土壤磷的活性很低；又因活性磷在土壤中易被固定，植物对磷肥的利用率亦极低[2]。这说明，植物可吸收利用的土壤有效磷缺乏，但土壤中储备着大量植物不能利用的磷，造成植物“遗传学缺磷”，而不是“土壤学缺磷”[3]。植物磷高效利用的研究主要有形态学、生理学以及遗传学3种机制[4-7]。植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症的微生物。可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生[8]。内生真菌主要是由子囊菌及其无性型组成，也包括少数担子菌和接合菌[9]。Carroll将内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌[10]。内生菌包括内生真菌(Endophyticfungi)和内生细菌(Endophyticbacteria)。内生真菌多样性研究表明，植物内生菌几乎存在于所有目前已研究过的植物中，分布广，种类多，对松属[11-13]、桤木属[11]、桉属[14-15]、冬青栎属[16]、山毛榉属[17]、红豆杉属[18]等已进行了广泛的研究。内生真菌的研究主要集中在两个方面：一是植物中的内生真菌对植物本身的影响，二是对植物内生真菌次生代谢产物的研究[19]。杉木(Cunninghamialanceolata)生长速率快、成材质量高[20]，属我国南方人工林中常用树种，也是南方经济林的主要树种。 【前人研究进展】近年来，由于营林管理和保护措施不规范，导致杉木林地生产力急剧下降，土壤地力衰退、营养缺乏，造成严重的生态和经济损失。为解决这些问题，恢复土壤肥力，提高杉木人工林可持续生产力，我国学者从混交、轮栽、改善林地结构和微生物处理等展开研究[21]。在低磷胁迫下接种内生真菌对杉木生长和光合作用的影响研究较少。【本研究切入点】本文选取低磷胁迫下的杉木作为研究对象，通过实验采集分析叶片、根系和土壤的酸性磷酸酶含量，并最终测定植株含磷量，分析内生真菌对杉木磷吸收的影响。【拟解决的关键科学问题】本研究为内生真菌提高植物抗逆性，促进生长和更加充分利用微生物和植物互作关系提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样地概况

本试验主要完成于福建农林大学的福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室。东经118°08′～120°31′，北纬25°15′～26°39′，该地区的平均气温温暖，一般为20～25 ℃，冬短夏长，约326 d的无霜期。年平均日照较长，高达1700～1980 h；年均降水量较大，约为900～2100 mm；年相对湿度约77%。此地常年受西伯利亚寒风和海陆气温差异的交替影响，形成夏季高温多雨、冬季温和少雨的气候特征。

1.2 供试材料

本试验进行土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省林科院提供的半年生杉木组培苗。

1.3 试验方法

选择生长相同的杉木幼苗定植于直径20 cm，高15 cm的塑料盆中，土盆加入经高压灭菌消毒过的黄心土5 kg，再经过甲醛严格熏蒸杀菌。为期两个月的生长后进行菌株接种试验。利用实验组前期通过试验获得的5株菌种，按照相同浓度配置100 mL菌液一次性施浇于幼苗体，进行5个重复的处理，设置无菌培养液为空白对照[2]。于15 d后进行低磷胁迫试验处理。

1.3.1 菌液制备 5株供试菌株：无柄盘菌属Peziculasp.(NG1)，毛霉属Mucorsp.(CG5)，拟青霉属Paecilomycessp.(AJ6)，丝葚霉属Papulosporasp.(AJ14)，青霉属Penicilliumsp.(AJ13)。其中，菌株AJ6以国家发明专利的方式保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，专利信息：一株能促进杉木磷吸收的内生真菌，保藏编号：No.9186。

设置相同水平的100 mL菌液：将供试菌株转接于50 mL液体培养基中，然后通过恒温振荡培养箱连续培养3 d。将菌液以无菌生理盐水按照十倍稀释法进行稀释，通过在显微镜下观察血球计数板计算并配制成5.5×106cfu/mL的浓度。将配置好的菌液从植物顶端施浇，确保其根、茎、叶及土壤中均有菌液，试验设置无菌液体培养基作为空白对照组。

1.3.2 低磷胁迫设计 通过施氮肥、钾肥及其他微量元素确保变量唯一，低磷胁迫采用KH2PO4。如表1所示，本试验设计了正常条件48 mg/kg、轻度胁迫24 mg/kg、中度胁迫12 mg/kg、重度胁迫0 mg/kg 4个磷处理水平，对照组浇水，每个水平5个重复[3]。在胁迫15、30、45、60 d时进行取样测定各项指标：叶片酸性磷酸酶活性、植株磷含量、根系酸性磷酸酶、根际土壤酸性磷酸酶、非根际土壤酸性磷酸酶。

表1 磷胁迫试验设计Table 1 Experimental design of phosphorus stress

实验所用土壤为黄心壤，其基质为pH 4.50、有机质含量20.5612 mg/g、全氮含量0.3054 mg/g、水解氮0.1205 mg/g、全磷含量0.4105 mg/g、有效磷含量0.0051 mg/g、全钾含量12.5012 mg/g、速效钾含量0.0245 mg/g。

1.3.3 酸性磷酸酶活性测定 叶片酸性磷酸酶活性测定参考林启美等[22]的方法。鲜叶用蒸馏水洗净吸干后，准确称取0.05 g立即放入含5 mL(pH 5.0)0.2 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液和5 mL 5 mmol/L对硝基苯磷酸二钠的具塞试管中，盖上玻璃塞，恒温培养箱30 ℃下暗处保持30 min。随之加入1 mL 1 mol/L NaOH终止反应，在波长为405 nm下进行比色。叶片酸性磷酸酶活性的单位为μg·g-1·h-1。

根系酸性磷酸酶活性测定参考陈永亮等[23](2006)的方法。鲜样洗净并吸干后，随机称取数条较细根并称取0.1 g，然后加0.2 mol/L的醋酸钠醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)5 mL。后进行冰浴匀浆。匀浆置于离心管中并在冰箱中放置1 h，然后10 000 r/min离心30 min。取1 mL上清液进行反应。

土壤酸性磷酸酶活性测定参考张海伟等[24](2010)的方法。称取0.3 g新鲜土样(<2 mm)于10 mL离心管中，加入4 mL 1 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0)，再加入2 mL 15 mmol/L的对硝基苯磷酸二钠。在37 ℃水浴中保温1 h后立即加入1 mL 1 mol/L NaOH终止反应，过滤后于405 nm下进行比色。土壤酸性磷酸酶活性用单位时间内每克土壤所含的酸性磷酸酶水解底物所生成的对硝基苯酚的微摩尔数来表示。

1.3.4 植株磷含量测定 参考中华人民共和国林业行业标准《森林土壤分析方法》[25]，采用H2SO4-HClO4消煮，钼锑抗比色法测定植株磷含量，每个样品做3个重复。

1.4 数据处理分析

数据的整理工作由Excel2010完成，数据的分析工作由SPSS19.0完成，相关图像处理由Origin9.0完成。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗酸性磷酸酶活性的影响

酸性磷酸酶(Acid Phosphatase Activity，以下简称APA)是土壤和植物体中普遍存在的一种非常重要的水解酶，其活性高低与植物体和土壤中的磷素丰缺状况有着密切的联系[26]。植物以改善自身的生理性状增强对磷的吸收量来应对低磷胁迫，如植物体内分泌酸性磷酸酶活化难溶性无机磷和有机磷。

2.1.1 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗叶片酸性磷酸酶活性的影响 由表2所示，正常条件下，各处理杉木幼苗的叶片APA活性在整个过程中均呈先上升后下降的变化趋势，其中，菌株CG5作用下的叶片APA活性在整个胁迫期间均比对照组高。轻度胁迫条件下，各处理杉木幼苗的叶片APA活性总体呈上升的变化趋势，且CG5菌株作用下的APA活性均比对照组高。中度胁迫条件下，不同处理均呈现先上升后下降的总体趋势，只有菌株AJ13呈一直上升的变化趋势；在叶片APA活性上，接菌植株在胁迫15 d时均比对照高，在胁迫至30 d时只有菌株NG1作用下的幼苗叶片APA活性比对照高，胁迫至45 d时接种菌株幼苗叶片APA活性均比对照低，胁迫至60 d时菌株AJ13和CG5作用下的幼苗叶片APA活性比对照高。重度胁迫条件下，AJ13菌株作用下的叶片APA活性在整个胁迫期间呈先上升后下降再上升的变化趋势，其余处理均为先上升后下降的变化动态；其中，菌株NG1作用下的叶片APA活性在整个胁迫动态均比对照活性强度高。

表2 低磷胁迫下接种各菌株对杉木幼苗叶片APA活性的影响Table 2 Effects of different endophytic fungi on leaf APA activity under low P in the Cunninghamia lanceolata seedling

综上所述，通过叶片APA活性的动态测定，在低磷胁迫条件下，不同杉木内生真菌接入的前期，菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14以及AJ13开始发挥解磷效力，杉木幼苗叶片APA活性在内生真菌作用下显著增加，与对照相比增加值最高可达190.27%。在胁迫中后期，APA活性与对照相比显著降低。其中，菌株CG5在正常条件和轻度胁迫条件下能显著提高宿主叶片APA活性，菌株NG1则在重度胁迫条件下对叶片APA活性的促进效果较显著，能促进杉木幼苗在低磷条件下的适应性。

2.1.2 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗根系酸性磷酸酶活性的影响 由表3可以看出，对照组随着胁迫梯度加重，根系APA活性不断下降；接种AJ13的变化趋势和对照组一致，但在正常条件下比对照组活性强度高27.3%。接种菌株NG1幼苗的根系APA活性呈先下降后上升的变化趋势，在重度胁迫条件下比对照组活性强度高215.55%；其中中度和重度胁迫处理之间差异显著(P<0.05)。接种菌株CG5幼苗的根系APA活性成先上升后下降的变化趋势，在轻度、中度、重度胁迫条件下分别比对照高61.11%、183.41%和136.42%，各处理之间差异不显著(P>0.05)。接种菌株AJ6幼苗的根系APA活性的变化趋势则是上下波动，各处理之间差异不显著(P>0.05)，各处理分别比对照组活性强度高11.39%、18.06%、111.94%、140.03%。而接种菌株AJ14幼苗的根系APA活性表现出先下降后上升的变化趋势，各处理分别比对照组活性强度高8.35%、15.20%、121.50%、233.21%；轻度和重度胁迫处理之间异显著(P<0.05)。综上所述，从不同胁迫处理梯度的角度出发，菌株AJ14在重度胁迫条件下对促进根系APA活性作用最大，菌株CG5在中度和轻度胁迫条件下作用最大，菌株AJ13在正常条件下的促进作用最大。

表3 低磷胁迫下各菌株对杉木幼苗根系酸性磷酸酶活性的影响Table 3 Effects of different endophytic fungi on root APA activity on under low P in the Cunninghamia lanceolata seedling (mg·h-1·g-1)

2.2 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗土壤酸性磷酸酶活性的影响

由图1和表4可知，非根际土壤APA活性的比较：菌株NG1、AJ6、AJ14作用下的土壤APA活性在不同胁迫梯度下变化不明显，菌株CG5作用下的土壤APA活性在重度胁迫下有略微的上升变化，而菌株AJ13作用下的土壤APA活性呈先上升后下降的变化趋势。根际土壤APA活性的比较：随着胁迫程度的加重，菌株NG1作用下的APA活性呈下降的变化趋势，菌株CG5和AJ6作用下的活性表现出上下波动的变化趋势，菌株AJ14作用下的活性无明显变化，菌株AJ13作用下的活性有小幅度下降的变化，对照则呈微弱的上升变化趋势。总体而言，接种内生真菌幼苗的根际土壤APA活性和非根际土壤APA活性基本上都比相应对照组的活性强度高，而根际土壤APA活性在多数情况下比非根际土壤APA活性要高。

不同小写字母表示同一胁迫梯度条件下不同菌种间差异显著( P<0.05)，不同大写字母表示同一菌种作用下不同胁迫梯度间有显著差异( P<0.05) Different small letters meant that the difference is significant between the different endophytic fungi under the same stress condition at the 0.05 level, different capital letters indicate that the difference is significant between the different stress condition with the same endophytic fungi at the 0.05 level图1 低磷胁迫下各菌株对杉木幼苗土壤酸性磷酸酶活性的影响Fig.1 Ratio of rhizosphere to non-rhizosphere on soil APA activity under low P in the Cunninghamia lanceolata seedling

表4 低磷胁迫下杉木幼苗土壤APA活性根际与非根际的比值Table 4 Ratio of rhizosphere to non-rhizosphere on soil APA activity under low P in Cunninghamia lanceolata seedling

2.3 低磷胁迫下不同菌种对杉木幼苗植株磷含量的影响

从表5可以看出，接种菌株幼苗的磷含量普遍比对照组高，只有重度胁迫条件下的NG1菌株作用下的地上部分和地下部分以及轻度胁迫条件下CG5菌株作用下的地下部分比对照组低。不同胁迫梯度下，植株地上部分的含磷量都比地下部分高。正常条件下，植株地上部分的磷含量由高到低为NG1、AJ13、AJ6、CG5、AJ14、CK；植株地下部分的磷含量由高到低为AJ6、CG5、AJ13、AJ14、NG1、CK。轻度胁迫条件下，植株地上部分的磷含量由高到低为AJ13、AJ6、NG1、AJ14、CG5、CK；植株地下部分的磷含量由高到低为AJ14、AJ6、NG1、AJ13、CK、CG5。中度胁迫条件下，植株地上部分的磷含量由高到低为NG1、CG5、AJ14、AJ13、AJ6、CK；植株地下部分的磷含量由高到低为NG1、AJ14、AJ13、CG5、AJ6、CK。重度胁迫条件下，植株地上部分的磷含量由高到低为AJ14、AJ6、CG5、AJ13、CK、NG1；植株地下部分的磷含量由高到低为AJ6、AJ14、CG5、AJ13、CK、NG1。综上所述，从整体上看，正常条件下，菌株AJ6、AJ13、NG1对植株整体含磷量的促进效果明显，地上部分和地下部分的磷含量分别比对照高115.12%和59.47%、122.28%和51.08%、128.18%和22.14%。轻度胁迫条件下，菌株AJ6、AJ14能有效提高植株磷含量，分别比对照高68.01%和32.31%、56.28%和35.16%。中度胁迫条件下，菌株NG1对植株磷含量的促进效果显著，且地上部分和地下部分的含磷量分别比对照高109.41%和177.64%；但在重度胁迫条件下没有促进效果，含磷量均比对照低。重度胁迫条件下，菌株AJ6效果最显著，地上部分和地下部分的磷含量分别比对照高51.91%和46.80%。

表5 低磷胁迫下不同内生真菌对杉木幼苗植株磷含量的影响Table 5 Effects of different endophytic fungi on the P content of plant under low P in the Cunninghamia lanceolata seedling

3 讨论与结论

叶片酸性磷酸酶活性在不同胁迫梯度不同菌株处理下基本呈先上升的总体趋势，这和梁霞[27-28]、张海伟[24]等的研究结果一致。从不同接种内生真菌的角度得出，菌株CG5在正常条件和轻度胁迫条件下能显著提高宿主叶片APA活性，菌株NG1则在重度胁迫条件下对叶片APA活性的促进效果较显著，能促进杉木幼苗在低磷条件下的适应性。CK随着胁迫水平的增加，根系酸性磷酸酶活性逐渐降低。接种不同内生真菌幼苗根系APA活性呈不同的变化趋势，且不同菌株在不同梯度的表现各异。菌株AJ14在重度胁迫条件下对促进根系APA活性作用最大，菌株CG5在中度和轻度胁迫条件下作用最大，菌株AJ13在正常条件下的促进作用最大。土壤酸性磷酸酶活性：接种内生真菌幼苗的根际土壤APA活性和非根际土壤APA活性基本上都比相应对照组的活性强度高。而根际土壤APA活性在多数情况下比非根际土壤APA活性要高。

通过对植株地上部分和地下部分的含磷量的测定来分析。钟安良等[29-30]通过施用不同比例的氮磷钾肥研究其对杉木苗期生长发育的影响，高氮缺磷或磷不足以及单施氮肥均不利于生长，磷肥有助于植物对氮肥的吸收。土壤中磷含量的多少对植物的生长起到十分重要的作用。菌株AJ6对植株磷含量的促进作用效果显著，尤其是在正常条件、轻度胁迫和重度胁迫条件下，且对植株地上部分磷含量的影响大于地下部分；菌株NG1在中度胁迫条件下能有效提高植株地上部分和地下部分含磷量。酸性磷酸酶活性及根系分泌酸性磷酸酶活性增加能否作为评价磷效率的生理生化指标一直是近年来学者研究的热点，但至今尚未达成观点上的统一。

在菌液的配制上，本研究仅探索了单一菌株对杉木幼苗的影响，希望今后有机会开展混合菌对杉木生长发育的影响。在胁迫梯度上，本研究仅设置了4个胁迫梯度，还存在一定的局限性，无法更好更全面地体现杉木对磷胁迫完整的响应机制。对于整个试验设计来说，由于时间的限制，仅研究了内生真菌-杉木共生体的各种特性，对各种响应机制的深层次原因无从涉及。对植株有显著促进作用的菌株，后续可开展对其次生代谢物质以及分子水平等相关领域的研究。