miR-34a、HMGB1及PCNA在宫颈上皮内病变中的表达及其临床意义*

万 兵，梁月娟，王 鹤

（广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科，南宁 530021）

宫颈癌（cervical cancer，CC）在全球女性诊断出的恶性肿瘤中居于第4位[1]，严重危害着广大女性的健康。高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus，HR-HPV）持续感染是CC 发生的最主要危险因素[2]，但并非都会发展成宫颈上皮内病变（squamous intraepithelial lesions，SIL）甚至CC。其他致病机制是近年来的研究热点，为SIL及CC的防治提供新思路。MicroRNA是一类高度保守的非编码RNA，其可结合到靶mRNA的3’-UTR，并与其他辅助蛋白降解靶mRNA 转录本/抑制其翻译成蛋白质[3]。MicroRNA 也可以作为原癌基因或抑癌基因参与癌症的发生发展[4]。miR-34家族中有miR-34a、miR-34b和miR-34c，参与p53调控途径[5]。miR-34a可调节细胞周期E2、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4/6、E2F转录因子、B淋巴细胞瘤2等蛋白[6]，并在CC[7]等肿瘤上发现其具有抗肿瘤活性，预测其可能是癌症诊断和治疗的潜在靶标。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-B1，HMGB1）是一种结合在DNA上高度保守的核蛋白，其在细胞内外发挥不同作用。细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）存在于细胞核中，被公认为细胞增殖的标志蛋白。HMGB1 参与组织修复、抑制凋亡、促进肿瘤血管的生成及肿瘤转移等，还可促进树突状细胞的成熟迁移和Th2 细胞的极化，引起免疫逃逸[8]。相关研究发现，HMGB1 是多种miRNA的直接靶标，PCNA和HMGB1的表达呈正相关关系[9-10]，但miR-34a 在调控SIL 进展及癌变的分子机制仍不清楚。本研究探讨miR-34a、HMGB1 及PCNA基因在SIL组织中的表达及其与临床病理因素的关系。

1 材料和方法

1.1 组织标本和病例的收集

收集广西医科大学附属肿瘤医院2016 年1 月至2019 年12 月收治的158 例SIL、宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，SCC）及因子宫肌瘤/子宫腺肌症切除子宫的患者宫颈组织标本及临床病理资料。将研究对象分为正常宫颈组（n=50）、SIL组（n=65）和SCC 组（n=43）。其中用于检测miR-34a 的正常宫颈组31 例、SIL 组织30 例、SCC 组31例，用于检测HMGB1、PCNA 的正常宫颈组38 例、SIL组52例、SCC组30例。所有标本取前患者均未行化疗、放疗及免疫治疗。本研究获得广西医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准，所有患者及其家属均已签署知情同意书。

1.2 细胞培养

SCC 细胞系SiHa 细胞由复旦大学附属上海市第五人民医院馈赠，STR鉴定匹配值为100%。SiHa细胞在含有10%胎牛血清+1%青链霉素的DMEM培养基中培养。CC前细胞系H8细胞购自中国科学院，在含有10%胎牛血清+1%青链霉素的1640培养基中培养，培养基、血清和抗生素均购自Gibco 公司。

1.3 RNA的抽提和实时荧光定量PCR（qPCR）

采用Trizol 法提取组织标本及细胞中的总RNA，并逆转录成cDNA，qPCR 检测各基因表达，Trizol、逆转录及qPCR 试剂盒均购自Takara 公司。miR-34a 引物序列为5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’；U6上游引物为5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’，下游为5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’；HMGB1 上游引物为5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，下游为5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’；PCNA上游引物为5’-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3’，下游为5’-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3’；GAPDH 上游引物为5’-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3’，下游为5’-CACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’。上述引物均由Takara公司合成。每个样品均检测3次，U6 和GAPDH 作为内参，采用2-ΔΔCT计算各样本中miR-34a 和细胞系中各基因的相对表达水平。HMGB1 和PCNA 基因在组织中的表达采用目的基因拷贝数/内参基因拷贝数进行统计学分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件对数据进行分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，方差不齐时选用t’检验；非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）[M（QR）]表示，组间比较使用曼－惠尼特U检验。多组之间比较采用方差分析，方差不齐的组间比较采用秩和检验，计数资料用百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理分析

3 组患者的年龄、孕次、绝经、HPV 感染情况比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。以年龄、绝经、孕次、产次、HPV感染为自变量，以诊断为SIL 及SCC 为因变量分别进行Logistic 单因素分析，结果显示患者年龄、孕次及HPV 感染均与SIL有关（P＜0.05），年龄、绝经、孕次、产次及HPV感染均与SCC有关（P＜0.05）。同时，将年龄、绝经、孕次、产次、HPV 感染纳入多因素分析，结果显示，孕次是SIL 和SCC 发生的保护因素，而HPV 感染是SIL 和SCC发生的危险因素（P＜0.05），见表2、表3。

表1 不同组别患者的临床病理分析

表2 影响SIL发生的危险因素的Logistic回归分析

表3 影响SCC发生的危险因素的Logistic回归分析

2.2 各组组织及细胞系中miR-34a、HMGB1 mRNA及PCNA mRNA的表达

2.2.1 miR-34a 的表达 miR-34a 在SIL组 和SCC组中的表达均显著低于正常宫颈组（均P＜0.001），且在SCC 组显著低于SIL 组（P=0.024）。在细胞系水平检测结果显示，miR-34a在H8细胞中的表达显著高于SiHa细胞（P＜0.001），见表4。

表4 各组织和细胞中的miR-34a表达

2.2.2 HMGB1 mRNA 的表达 HMGB1 在正常宫颈组和SIL 组中的mRNA 表达均显著低于SCC 组（P=0.001,P=0.038），且在正常宫颈组显著低于SIL组（P=0.039）。HMGB1在H8细胞中的mRNA水平显著低于SiHa细胞（P=0.005），见表5。

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2.2.3 PCNA mRNA的表达 PCNA在正常宫颈组和SIL组中的表达均显著低于SCC组（P=0.033,P=0.004），但在正常组和SIL组差异无统计学意义（P=0.967）。PCNA 在H8 细胞中的mRNA 水平显著低于SiHa细胞（P=0.045），见表6。

表5 各组织和细胞中的HMGB1表达

表6 各组织和细胞中的PCNA表达

2.3 不同临床病理因素的患者miR-34a 表达的差异 miR-34a在HPV阳性的SIL和SCC组织中表达均较HPV 阴性者显著下降（P=0.028，P=0.039），同时，有淋巴结转移者miR-34a 表达显著下调（P=0.015）。其余临床病理因素与各组miR-34a 的相对表达量无明显相关性，见表7、表8。

表7 患者临床病理特征与miR-34a在正常组及SIL组中表达情况的关系M（QR）

表8 患者临床病理特征与miR-34a在SIL组及SCC组中表达情况的关系M（QR）

3 讨论

3.1 miR-34a表达与SIL的关系

SIL发展为宫颈原位癌、浸润癌是一个多基因、多因素参与，经历多阶段的过程，而miRNA 在此过程中扮演着重要角色。miR-34a上游启动子存在高度保守的p53 蛋白结合位点，还可通过靶向下调E2F3 表达在p53-miR-34a-E2F3-p53 通路和靶向SIRT1增强p53表达形成p53-miR-34a-SIRT1-p53正反馈通路增强miR-34a 的表达[11-12]，抑制细胞增殖，阻止细胞周期G1 期/S 期的转变和促进细胞凋亡。Gocze等[7]发现miR-34a在CIN II～III中的表达水平显著低于CINⅠ。同时miR-34a表达下调可促使肺癌[13]、乳腺癌[14]、CC[15]、前列腺癌[16]等肿瘤的发生。本研究发现，miR-34a 在SIL 和SCC 组织较正常宫颈组织表达均显著下调（均P＜0.001），且SCC组显著低于SIL组（P=0.024）。同时，miR-34a在H8细胞中的表达显著高于SiHa 细胞（P＜0.001）。说明miR-34a在SIL和SCC组织中、H8和SiHa细胞中的表达趋势是一致的，随着宫颈病变程度加重，miR-34a表达逐渐降低。

3.2 HMGB1表达与SIL的关系

研究表明，HMGB1 是miR-34a 的直接靶标，参与肿瘤的发生发展[9-10]。Yu 等[17]发现HMGB1 在慢性宫颈炎患者与CINs 的阳性染色率均显著低于浸润性SCC，随着宫颈病变的加重而表达升高。Pang等[8]发现HMGB1 的表达是随着宫颈病变的进展而显著性上升，与FIGO 分期、淋巴结转移显著相关。本研究结果与上述一致，HMGB1 在SCC 组中mRNA 水平均显著高于正常宫颈组和SIL 组（P=0.001，P=0.038），且SCC 组显著高于SIL 组（P=0.039）。HMGB1 在H8 细胞中mRNA 水平显著低于SiHa 细胞（P=0.005）。说明HMGB1 在SIL 和SCC 组织中、H8 和SiHa 细胞中的表达趋势是一致的，随着宫颈病变程度的加重，HMGB1表达逐渐升高。

3.3 PCNA表达与SIL的关系

研究发现，PCNA 在Base excision repair通路中是HMGB1的下游分子，敲低HMGB1可抑制PCNA表达，抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭[18-20]。PCNA是细胞增殖的标志蛋白，在肿瘤中可作为反映增殖程度与判断预后的重要指标。Wang 等[21]发现PCNA 在正常宫颈和炎症性宫颈为阴性表达，在CIN组（63.2%）和SCC组（100%）中表达显著增加，并预测PCNA 可能是CC 进展的临床标志物。但Branca等[22]在正常宫颈中发现PCNA 的表达，认为不可将其作为CC 筛选的潜在指标，还发现上调PCNA 表达与HR-HPV 和CIN 进展密切相关，但不能预测CIN 治疗后HR-HPV 的清除。本研究发现，PCNA在SCC组中的表达均显著高于正常宫颈组和SIL组（P=0.033，P=0.004），但正常宫颈组和SIL 组中的PCNA表达比较，差异无统计学意义（P=0.967）。H8细胞中的mRNA 水平也显著低于SiHa 细胞（P=0.045）。说明与HMGB1 的表达一致，PCNA 在SIL和SCC 组织、H8 和SiHa 细胞中的表达也是随着宫颈病变程度的加重而逐渐升高的。

3.4 miR-34a表达与患者临床病理特征的关系

本研究发现，相比HPV 阴性的SIL 及SCC 组织，HPV 阳性的组织中miR-34a 的表达显著降低（P＜0.05）。Gocze等[7]报道miR-34a在CIN I进展为CIN Ⅱ～Ⅲ和CIN Ⅱ～Ⅲ进展为CC阶段均与HPV16阳性显著相关。Geng 等[11]发现HR-HPV 阳性的正常宫颈组织、CIN组织及CC组织中miR-34a均显著下调，并向Hela 和SiHa 细胞转染miR-34a，细胞活力和集落形成能力均显著下降。同时，本研究还发现，有淋巴结转移者miR-34a 表达显著下调（P=0.015）。Wang等[23]研究发现miR-34a低表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及FIGO 分期相关，miR-34a低表达的患者预后较差，并预测miR-34a可作为CC诊断和预后的参考指标。

综上所述，随着宫颈病变程度的加重，miR-34a的表达逐渐降低，下调的miR-34a 调控HMGB1 表达的能力下降，HMGB1 表达的增强促进其下游分子PCNA表达升高，进一步促进细胞恶性增殖，抑制P53抑癌通路，促使细胞发生癌变和转移。同时，H8细胞和SiHa细胞上验证miR-34a、HMGB1和PCNA的表达趋势与组织一致。miR-34a、HMGB1 及PCNA有望成为预警SIL进展的新靶标。