基于单细胞RNA测序探讨膀胱癌患者外周血单个核细胞特征的研究*

包梦颖，曾燕玉，代 艳，黄 荣，毛星宁，颜赟坤，张庆云，郭冰倩，叶 雨，莫曾南△

（广西医科大学 1.基因组与个体化医学研究中心；2.广西生物医药协同创新中心广西－东盟重大疾病防治协同创新中心；3.广西基因组与个体化医学研究重点实验室；4.广西基因组与个体化医学研究协同创新中心，南宁 530021；5.广西医科大学第二附属医院，南宁 530000；6.广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021）

膀胱癌是第五大常见的肿瘤，全球每年有超过43万名患者被诊断为膀胱癌[1]。目前许多基因表达谱的研究是针对来自患者或健康人的活检组织，在取材的过程中具有一定的损伤性。由于外周血取材简单且不具有侵入性的损伤，因此外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）已经成为了研究基因表达谱的重要样本来源[2-4]。目前已有研究发现术前中性粒细胞与淋巴细胞比例（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）升高可预示可手术切除的泌尿系肿瘤（包括膀胱癌）预后较差[5]，这说明外周血在一定程度上能够反映膀胱癌患者手术治疗后的预后情况。但膀胱癌外周血的特征差异方面的研究较为欠缺。

单细胞RNA 测序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术是对单个细胞进行RNA 测序，能够在单细胞分辨率下生成单个细胞的独特的转录组并建立基因调控网络[6]。这项技术已经在肿瘤免疫微环境[7-8]和细胞异质性[9-10]研究方面得到广泛应用。Luo等[11]对终末期肾脏疾病患者的PBMC进行scRNA-seq 技术研究，绘制了单细胞图谱发现了8种新的细胞类型和揭示了细胞间的异质性，并找到了驱动终末期肾病的关键因素。

本研究的主要目的是基于scRNA-seq技术对膀胱癌患者与健康人中PBMC进行分群，比较膀胱癌患者与健康人的PBMC中的特点和组成差异，为进一步研究膀胱癌患者PBMC 提供了一个新的研究方案。

1 材料和方法

1.1 一般资料

为了反映健康人的普遍情况和肿瘤病人个体特征，收取2019 年11 月在广西医科大学附属肿瘤医院经诊断为膀胱癌患者的术前肝素钠抗凝外周血1例和收取3位健康人空腹肝素钠抗凝外周血。

膀胱癌患者纳入排除标准：（1）泌尿系彩超，CT，膀胱镜检，病理活检结果术前诊断为膀胱尿路上皮癌；（2）术后病理诊断为尿路上皮癌。排除标准：（1）术前接受过放化疗治疗；（2）患者有自身免疫性疾病，或肾功能不全等疾病。

健康人纳入排除标准：（1）年龄在55～75岁；（2）既往未合并高血压、糖尿病、痛风、自身免疫性疾病、肝肾功能不全、传染性疾病、高类固醇血症和肿瘤疾病。

本研究中研究患者为男性，64 岁，病理结果诊断为膀胱尿路上皮癌T2aN0M0。健康人分别是男性，59岁；男性，68岁；女性，68岁。本研究通过了广西医科大学医学伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

1.2 试剂、仪器和分析软件

1.2.1 试剂和仪器 人PBMC 分离液购于北京索莱宝科技有限公司；杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）购于加拿大维森特公司；红细胞裂解液购于美国Bio-Legend 公司；台盼蓝购于美国Gibco 公司。水平离心机购于湘仪离心机仪器有限公司；单细胞油包水制备和转录组文库构建试剂盒（Chromium Single Cell 3’GEM,Library&Gel Bead Kit v3、Chromium Chip B Single Cell Kit 和Chromium i7 Multiplex Kit）、Chromium Single Cell Controller 购于美国10X Genomics公司。

1.2.2 分析软件 Cell ranger（version 3.1.0），R 语言（version 3.5.1），Rstudio，单细胞RNA测序数据分析Seurat包。

1.3 实验方法

1.3.1 PBMC 制备 按照1∶1 比例用DPBS 稀释肝素钠抗凝血。按照分离液和血液2∶1的比例将稀释后的血液缓慢滴加至人PBMC 分离液液面上。500 g，无刹车离心25 min。吸出离心后分离出的白膜层，用5倍的DPBS清洗后，350 g，离心5 min收集细胞。加入5 mL 红细胞裂解液裂解10 min 后加入等量的DPBS 混匀后，350 g，离心5 min。弃去上清后，用DPBS 清洗一遍后，再加入适当体积的DPBS重悬，台盼蓝染色镜检计数和计算细胞活率，要求细胞活率大于80%。

1.3.2 PBMC 单细胞RNA 测序 采用基于液滴的scRNA-seq 平台，按照10X Genomics Single Cell 3'v3试剂盒的说明书中的实验步骤进行油包水与文库制备。其中1位膀胱癌患者的PBMC作为一例样本上机，健康人PBMC 的样本是由3 个健康人的PBMC悬液等比例均匀混合成一例PBMC的样本上机。在芯片上分别加入样本（每个样本加载细胞数为22 000 个），Master Mix,Gel Beads 和Partitioning Oil，在Chromium Single Cell Controller 仪器中形成油包水GEMs (Gel Bead-in-Emulsions)。再进行细胞裂解与RNA 逆转录后，将cDNA 进行扩增纯化，片段化，加接头和Index 构建文库，最后用illumina测序仪进行测序。

1.4 单细胞RNA测序数据分析

1.4.1 原始数据处理和数据质控 首先将测序产生的原始数据转换成Fastq文件，并比对人类基因组序列对数据进行初步处理。然后用Cell Ranger V3.1.0对数据进行初步质控和生成生成基因表达矩阵(matrix.mtx.gz)，基因表(genes.tsv.gz)和细胞条形码表(barcodes.tsv.gz) 文件。然后使用R3.5.1 和Seurat3.1.1 对数据进一步处理，过滤排除掉线粒体基因比例较高的细胞，通过设定阈值，过滤掉基因数小于200 或大于3 000 以及线粒体基因比例大于10%的低质量细胞。然后将不同细胞之间变异差异系数较大的1 500个基因挑选出进行后续的分析。

1.4.2 降维聚类和细胞注释 根据MergeSeurat 功能将健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC 这两例数据整合在一起，运行主成分（principal component，PC）分析，用ElbowPlot 函数绘制所有PC 的分布点图，取拐点处对应的PC作为dim值。选择合适的分辨率，用FindClusters 功能将细胞聚类。接下来，使用FindAllMarkers功能来查找每种类型细胞之间的差异基因。根据细胞差异基因和细胞类群特征基因的表达对细胞进行注释。

2 结果

2.1 单细胞测序分析膀胱癌外周血转录组特异性的流程

为了绘制膀胱癌患者和健康人PBMC 单细胞图谱，探究PBMC细胞亚群之间的差异特征和发现特异类群。从1例膀胱癌确诊患者的术前外周血和3 位健康人的外周血中分离出单个核细胞，制成PBMC 悬液，利用10X Genomics 单细胞RNA 测序平台进行单细胞RNA测序，得到了1例膀胱癌患者和1例健康人的PBMC数据。利用Cell Ranger对原始数据进行初步处理，从健康人的PBMC数据中获得了11 602 个细胞，膀胱癌患者PBMC 中获得了9 480 个细胞。再用R3.5.1 和Seurat3.1.0 对处理后的数据进一步分析过滤掉低质量的细胞后进行后续的生物信息学分析，见图1。

2.2 健康人和膀胱癌患者PBMC scRNA-seq 数据分析

首先分别比较健康人和膀胱癌患者PBMC 单细胞测序数据中每个细胞的基因数、count 数、线粒体分布和血红蛋白基因分布情况（图2A、图2B），以及计算出每个细胞count 数分别与线粒体基因占比、基因数之间的关系（图2C、图2D）。根据图中的基因数和线粒体数分别设置过滤参数，设定阈值，过滤掉基因数小于200 或大于3 000 以及线粒体基因比例大于10%的低质量细胞。过滤掉低质量数据后得到来自健康人PBMC的7 523个细胞和来自膀胱癌患者PBMC的5 289个细胞。

2.3 健康人和膀胱癌患者PBMC 单细胞图谱聚类结果

随后使用Seurat 包中的MergeSeurat 函数将过滤掉低质量数据后的健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC数据整合在一起，应用PC分析和基因表达的相似性评估，利用FindClusters功能，将PC分布中的拐点值20作为dim值，分辨率设置为0.28，最终整合后的PBMC 被细分为15 群（图3A、图3C）。健康人PBMC 和膀胱癌患者PBMC 有很强的重合性，基本每个类群的细胞在两例PBMC数据中均能找到，仅第11群主要来自膀胱癌患者（图3B）。

图1 膀胱癌患者和健康人PBMC提取和单细胞RNA测序流程图

图2 健康人和膀胱癌患者PBMC数据质控

图3 健康人和膀胱癌患者PBMC的UMAP聚类图

根据每个亚群特征基因表达情况来对各亚群进行注释命名（图4A，表1），从整合后的外周血数据中鉴定出了T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞和血小板。根据CD3D、CD3E、CD3G、CD4、CD8A和CD8B基因的表达情况发现T细胞被分成了7群，并且鉴定出0、6、12 群为CD8+T 细胞，2、4、8、13 群为CD4+T 细胞（图4B）。根据T 细胞不同功能状态的特征基因的表达（表1），分别定义出初始T 细胞（naïve T cells）、效应性T细胞（effector T cells）、细胞毒性T 细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）、中央记忆性T细胞（central memory T cells）、效应记忆性T 细胞（effector memory T cells）和调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）。

根据自然杀伤（natural killer，NK）细胞的特征基因NCAM1(CD56)、FCGR3A(CD16)、NKG7的表达，将1、3群定义为NK细胞（图4B）。第14群既表达NK 细胞基因又表达T 细胞基因，同时特异表达增殖性基因MKI67和TUBB（图4A），将其定义为增殖性的NKT 细胞（proliferative NKT cells）。同时也发现了7、10、11 这三个亚髓系细胞群，分别是经典单核细胞（classical monocytes）、非经典单核细胞（non-classical monocytes）和粒细胞（granulocytes），见表1。

2.4 各类型细胞在外周血中分布和特征

在整合后的PBMC 数据中，T 细胞占细胞总数的50%以上，其中CD4+T 细胞和CD8+T 细胞各占一半。NK 细胞占细胞总数的26%，髓系细胞占7.5%，B细胞占6.4%，血小板占1.9%（图5A左）。同时发现占比最多的细胞亚群是CD8+效应性T 细胞（19.6%），最少的细胞亚群是增殖性的NKT 细胞（0.4%）。

接着分别对膀胱癌患者和健康人的PBMC 中各个亚群细胞分布进行研究（图5A右）。对比发现健康人PBMC 中CD8+T 细胞占比更多（占比31.6%），特别是CD8+效应性T 细胞（占比24.2%）。而CD4+T细胞在膀胱癌患者PBMC中占比更多，尤其是CD4+记忆性T细胞，CD4+初始T细胞和Treg细胞在患者PBMC 中占比显著高于健康人。特别是发现膀胱癌患者和健康人PBMC 中的髓系细胞类群也有较大的差异，健康人PBMC中经典单核细胞和非经典单核细胞均多于膀胱癌患者，但粒细胞几乎完全来源于在膀胱癌患者。

通过研究健康人和膀胱癌患者PBMC 中CD8+效应性T细胞的基因的相关性，发现患者的CD8+效应性T 细胞和健康人CD8+效应性T 细胞的基因具有很强的相关性。不同的是膀胱癌患者中高表达DUSP2、CXCR4等基因，而健康人高表达GNLY、IFITM2、IL7R和S100B(图5B)，这提示着健康人PBMC中的效应性T细胞可能具有更强的杀伤功能。

图4 特征基因在各类群细胞的表达情况展示

表1 各个类群定义细胞类型的特征基因

图5 各细胞亚群在外周血中的占比

3 讨论

膀胱癌是较为常见的泌尿系统肿瘤，具有易复发和预后较差的特点[16]。目前有关膀胱癌患者的外周血方面的研究并不是很多。之前有人对浅表非侵袭性和侵袭性尿路上皮癌患者的外周血中的髓系细胞进行研究[17]，他们在膀胱癌患者的PBMC 中发现了粒细胞型和单核细胞型这两类髓样细胞亚群。Audenet 等[18]发现高危非肌层浸润型膀胱癌（Non-muscle Invasive Bladder Cancer，NMIBC）患者的PBMC的免疫表型与健康人的有显著差异，但是这项研究主要对PBMC中的T细胞和NK细胞进行比较分析，发现NMIBC患者中NK细胞的数量会显著高于健康人。以上研究主要基于流式细胞术探讨已知细胞标志的类群，并且其结果与笔者scRNAseq结果有一定相似性。流式细胞术是利用已知的抗体标记细胞，其参数有限，并且荧光通道间会有干扰，因此流式细胞术不利于发现罕见的或者新的细胞类群，对目的细胞的其他特点无法进一步探索，更无法研究细胞间的异质性。而scRNA-seq 是在单细胞水平上同时表征数千个细胞基因表达谱的最新方法[19]，能够无偏倚的揭示每个细胞的基因表达谱，揭示每个细胞特点和特异的基因结构，是发现新的免疫细胞群体和细胞间异质性的好方法。

本研究利用scRNA-seq技术的优势对健康人和膀胱癌患者的PBMC做细致分群，比较来自不同样本的各细胞亚群。结果显示，笔者将健康人和膀胱癌患者的PBMC细分了15群，其中包括3个CD8+T细胞亚群，4 个CD4+T 细胞亚群。本研究还发现膀胱癌患者PBMC 中以CD4+T 细胞为主，CD4+Treg细胞比率较健康人显著增高。而CD8+T 细胞较健康人相比显著减少，尤其是具有杀伤功能的效应性T 细胞，同时健康人CD8+效应性T 细胞中高表达颗粒溶素GNLY基因，提示着具有更强的杀伤性。以上这些结果表明膀胱癌患者中机体抗肿瘤免疫反应受到抑制，可能与膀胱癌患者免疫功能低下以及跟肿瘤发生发展有密切关系。特别是笔者在膀胱癌患者的PBMC中发现了粒细胞，这一结果与Eruslanov 等[17]发现膀胱癌患者中循环的粒细胞数量明显增加的结果相一致。

综上所述，本实验结果与利用流式细胞术对PBMC的研究和既往对膀胱癌病人PBMC相关研究发现相吻合且有新的发现，由此可以说明本研究利用scRNA-seq 技术成功建立了研究膀胱癌病人PBMC 的特征的方法，也为后续进一步研究膀胱癌患者PBMC 的特征奠定了研究基础和提供了一定的参考依据。但本研究也具有一定的局限性，由于研究的样本量太少，发现的结果仅具有一定的提示性，不具有统计学意义，因此需要扩大样本量进一步验证。