多西环素对碱烧伤大鼠角膜中波形蛋白和纤维连接蛋白表达的影响*

陈 迪，谭少健，邹文进

(广西医科大学第一附属医院眼科，南宁 530021)

眼部化学烧伤在各种场合均很常见，眼化学烧伤的发生率占所有眼外伤的7.7%～18.0%，并且碱性烧伤通常比酸性烧伤的发生率更高、危害更大[1]。角膜碱烧伤由于纤维化引起的角膜混浊而导致不可逆的视力丧失通常需要进行角膜移植以恢复视力，这仍然是一项巨大挑战[2]。多西环素是一种四环素类抗生素，具有较强抗菌、抗炎及免疫调节的作用，在角膜碱烧伤模型中具有强大的抗炎及抑制新生血管作用[3]。本课题组之前的研究已经表明多西环素通过抑制TGF-β1及α-SMA的表达来减轻碱烧伤大鼠角膜混浊程度[4-5]，其具体抗纤维化机制还有待进一步的研究。近年来的研究表明，角膜创伤后基质细胞被激活产生大量细胞外基质（ECM）堆积在细胞间形成角膜混浊。波形蛋白(Vim)和纤维连接蛋白（Fn）被认为是成纤维细胞的标记物[6]，这种ECM蛋白是影响角膜纤维化的重要指标。因此，本次研究以大鼠角膜碱烧伤为模型，观察多西环素对碱烧伤大鼠角膜中Vim 和Fn 表达的影响，探索多西环素抑制碱烧伤大鼠角膜纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康雄性SPF级SD大鼠54只，体重180～220 g，由广西医科大学实验动物中心提供。实验前所有大鼠均通过裂隙灯排查眼前节疾病。按随机数字表法将大鼠分为对照组和多西环素组，每组27 只（27 眼），均以右眼为实验眼。实验遵循国家实验动物管理保护条例，动物实验已获得动物伦理委员会的批准。

1.2 SD大鼠角膜碱烧伤模型的制备 碱烧伤模型制备前1 d 用5.0 g/L 妥布霉素眼液点眼4 次预防感染。按照4 mL/kg 体质量向腹腔内注射100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠，丁卡因眼液滴眼行表面麻醉，棉签擦干结膜囊内多余液体。自制碱烧伤模具：200 μL容积的枪头距尾部15 mm处水平切去枪头前端，用刀片小心将切口端外部削薄，在枪头内填塞适量棉花，使枪头切口端外露的棉花形成一个平整微凸面，松紧度适中，枪头尾部用纸胶布封贴，高压高温灭菌备用。于模具内滴入200 μL 1 mol/LNaOH，将模具垂直放置于大鼠右侧角膜中央25 s，迅速用20 mL生理盐水冲洗烧伤区及结膜囊1 min，冲洗完毕后可见角膜中央有一圆形灰白色烧灼斑，直径约4 mm。显微镜下观察角膜基质层水肿、混浊且虹膜隐约可见。碱烧伤后立即给予眼液滴眼，多西环素组以1.0 g/L 多西环素（美国Sigma）点眼，对照组以眼液溶媒点眼，溶媒除不含多西环素外，其余成分均与多西环素眼液相同，4次/d，20 μL/次，至临床观察期结束，即碱烧伤后第14天。

1.3 角膜浑浊程度评分 建模成功后，分别在角膜碱烧伤后第3、第7、第14天对各组大鼠角膜进行混浊程度评分。角膜混浊程度的评分参照Holland 等的标准[7]：0 分：角膜透明无混浊；1 分：角膜轻度混浊，虹膜纹理可见；2分：角膜混浊较重，虹膜纹理不清；3分：角膜混浊进一步加重，但可见瞳孔；4分：角膜完全混浊，看不清瞳孔。

1.4 炎症细胞计数 建模成功后，分别在角膜碱烧伤后第3、第7、第14天每组随机选取4只大鼠处死，用无菌手术器械沿角膜缘快速取下角膜，4%中性甲醛固定、常规梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、苏木精－伊红（HE）染色及中性树胶封片。于400 倍镜下（日本Olympus）记录各时间点切片中角膜周边部、中周部及角膜中央共5 个视野，通过Image J 软件进行炎症细胞计数。

1.5 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测角膜中Fn mRNA和Vim mRNA的表达 建模成功后，分别在角膜碱烧伤后第3、第7、第14 天每组随机选取5 只大鼠处死，用无菌手术器械沿角膜缘快速取下角膜，将角膜组织于装有裂解Buffer R1的1.5 mL离心管内进行匀浆，提取角膜组织总RNA（美国Axygen），进一步逆转录成cDNA 并进行qPCR 反应（日本TaKaRa）。qPCR 反应条件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s；Fn、Vim 及β-actin 均为40 个循环。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。引物由南宁捷尼斯生物科技有限公司设计并合成，引物序列如下：Fn-F：5’-CCACCATCACTGGTCTGGAG-3’，Fn-R：5’-GGGTGTGGAAGGGTAACCAG-3’；Vim-F：5’-TGCGGCTGCGAGAAAAATTG-3’，Vim-R：5’-GGTCAAGACGTGCCAGAGAA-3’；β-actin-F：5’-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3’，β-actin-R：5’-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3’。

1.6 免疫荧光检测 采用石蜡切片（5 μm）进行免疫荧光染色，抗原修复后用10%驴血清封闭30 min，加入Fn（1∶200）和Vim（1∶200）一抗（英国abcam），4 ℃冰箱孵育过夜，加入荧光二抗CY3 山羊抗兔（1∶300）/488 山羊抗小鼠（1：400）（武汉赛维尔生物）避光室温孵育50 min，再加入DAPI染液复染细胞核，避光室温孵育10 min，最后淬灭组织自发荧光后用封片。于200倍镜下（日本Olympus）各时间点随机选取3 个视野，采用Image J 软件分别对Fn 及Vim的阳性荧光面积进行测量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，所有实验数据以均数±标准差()表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 角膜混浊程度评分 建模成功后第3、第7、第14 天在眼科显微镜下对各组大鼠进行活体观察。角膜碱烧伤后第3天：两组均表现为角膜上皮缺损、基质层水肿、混浊且虹膜纹理不清，两组间角膜混浊程度评分比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。碱烧伤后第7 天：对照组角膜水肿较重、基质混浊，瞳孔隐约可见；多西环素组角膜水肿较轻，虹膜纹理不清；多西环素组角膜混浊程度轻于对照组(P＜0.05)。碱烧伤后第14天：对照组可见新生血管长入碱烧伤区，瞳孔不可见；多西环素组角膜基质水肿消退，角膜少量云翳，虹膜纹理清晰；多西环素组角膜混浊程度轻于对照组(P＜0.05)，见图1、表1。

图1 碱烧伤后各时间点两组角膜混浊程度情况

表1 碱烧伤后各时间点两组角膜混浊程度评分分，

表1 碱烧伤后各时间点两组角膜混浊程度评分分，

与对照组比较，#P＜0.05。

2.2 角膜炎症细胞计数 在第3、第7、第14 天，多西环素组角膜炎症细胞数量均少于对照组（P＜0.05），见表2。角膜碱烧伤后第3天：两组均表现为角膜上皮细胞水肿，2～3层细胞，基质层水肿且排列疏松，但多西环素组炎症细胞较少。碱烧伤后第7天：对照组角膜上皮细胞稍水肿，4～6 层，基质层水肿明显，纤维排列紊乱，可见大量炎症细胞浸润；多西环素组角膜上皮细胞基本愈合，4～5层，基质层水肿较轻，纤维排列尚规则，可见少量炎症细胞浸润。碱烧伤后第14 天：对照组角膜上皮细胞4～6层，基质层仍可见水肿，纤维排列不规则，较多炎症细胞浸润；多西环素组角膜上皮完全修复，纤维排列规则，极少量炎症细胞浸润，见图2。

表2 碱烧伤后各时间点两组角膜炎症细胞计数个，

表2 碱烧伤后各时间点两组角膜炎症细胞计数个，

与对照组比较，#P＜0.05。

图2 碱烧伤后各时间点两组角膜炎症细胞变化（HE，×200）

2.3 免疫荧光染色 角膜碱烧伤后第3、第7、第14天分别对两组大鼠角膜进行免疫荧光染色，红色荧光代表Fn，绿色荧光代表Vim，蓝色荧光代表细胞核。碱烧伤后第3、第7、第14 天多西环素组Fn 及Vim 的阳性荧光面积（Area%）均较对照组小（P＜0.05），见图3。

2.4 Fn mRNA和Vim mRNA的相对表达情况角膜碱烧伤后第3、第7、第14天多西环素组Fn mRNA 和Vim 的mRNA 水平均较对照组低(P＜0.05)，见表3、表4。

图3 碱烧伤后各时间点两组角膜Fn及Vim免疫荧光强度（IF,×200）

表3 碱烧伤后各时间点两组角膜中Fn mRNA相对表达量以及蛋白水平比较

表3 碱烧伤后各时间点两组角膜中Fn mRNA相对表达量以及蛋白水平比较

与对照组比较，#P＜0.05。

表4 碱烧伤后各时间点两组角膜中Vim mRNA相对表达量以及蛋白水平比较

表4 碱烧伤后各时间点两组角膜中Vim mRNA相对表达量以及蛋白水平比较

与对照组相比，#P＜0.05。

3 讨论

化学损伤引起角膜混浊的发病机制是复杂的分子信号事件级联，涉及多种纤维化途径和ECM的重塑[8]。目前大部分学者认为，当角膜受到创伤后，角膜基质细胞激活、增生、转化，激活的基质细胞产生大量ECM堆积在细胞间，基质纤维排列紊乱形成角膜混浊。Vim 是角膜纤维化中必需的Ⅲ型中间丝，被认为是角膜纤维化的新靶标[9-10]，在角膜被碱性物质灼伤后，角膜基质细胞激活并迁移至碱烧伤区转化成高表达Vim的肌成纤维细胞[11]。Bargagna-Mohan等[12]通过研究发现，阻断Vim的表达，可以降低碱烧伤角膜的纤维化，从而提高角膜透明度。Das 等[13]在角膜创伤模型中也有类似的发现，敲除Vim 可以预防角膜纤维化。Fn 是一种存在于角膜基质层中的高分子糖蛋白，它的主要功能是连接细胞与基质以及细胞与细胞，在组织纤维化过程中起着重要作用。有研究表明，在大鼠角膜碱烧伤后Fn表达量急剧增加，它参与了碱烧伤角膜伤口的愈合过程[14]。Shi 等[15]发现，TGF-β1 可以通过JNK 信号途径促进成纤维细胞中Fn的表达，最终导致角膜纤维化。因此，Fn的过度表达也可能是造成角膜纤维化的重要原因。陶丹等[16]的研究验证了这一观点，她发现减少ECM-FN 的表达可以减轻PKA 术后角膜基质混浊的程度。Vim 及Fn 作为角膜基质纤维化的新的标记物，阻断其表达可能成为治疗角膜基质混浊的新方法。

本次实验用眼科显微镜对碱烧伤后角膜混浊程度评分并进行了统计学分析，实验结果表明碱烧伤后第3 天两组角膜混浊程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在碱烧伤后的第7 天和第14 天，多西环素组均比对照组的角膜混浊程度轻（P＜0.05）；碱烧伤后第14天，对照组角膜基质混浊，遮挡瞳孔，可见新生血管长入碱烧伤区，而多西环素组仅有少量角膜云翳，角膜几乎恢复透明，表明多西环素可以有效减轻碱烧伤大鼠角膜的浑浊程度。

多西环素是四环素类抗生素，具有很强的抗炎和免疫调节的作用。多西环素还有一定的抗纤维化作用，其抗纤维化作用主要是通过抑制ECM的生成和重塑来实现的，对Fn及Vim的调节作用已有报道，它可以抑制呼吸道上皮细胞中TGF-β1 诱导的Vim、Fn 以及α-SMA 的表达，减轻鼻旁窦黏膜破坏后引起ECM沉积，最终抑制鼻息肉的形成[17-18]；可以作为肝细胞癌上皮－间充质转化和血管生成拟态的抑制剂，通过抑制间质标记物-Vim的表达来延缓上皮－间充质转换的进程，最终延长肝细胞癌小鼠的生命[19]；还可以抑制平滑肌细胞中ECM蛋白Vim和Fn 的表达来减轻动脉粥样硬化[20]。本研究结果显示，对照组在碱烧伤后第3天炎症细胞开始增多，第7 天达到顶峰，第14 天时逐渐消退；对照组Fn 及Vim mRNA和蛋白质的表达量在碱烧伤后第3天的时候也已经开始表达增加，在第7天就达到峰值，随后逐渐降低，与炎症细胞浸润的趋势基本保持一致；笔者推测，Fn 及Vim 的表达与角膜炎症反应可能存在一定的关系。多西环素组各时间点的炎症细胞计数、Fn及Vim mRNA和蛋白质的表达量均较对照组轻（P＜0.05）。提示多西环素可降低Fn 及Vim 的表达，减少炎症反应。本课题组之前的研究已经表明多西环素可以抑制碱烧伤大鼠角膜中NFκB、TGF-β1 及α-SMA 的表达，本次研究结果表明多西环素还可以抑制Fn 及Vim 的表达来减轻角膜纤维化，那么在碱烧伤模型中，Fn 及Vim 的表达是否与TGF-β1、NF-κB 的表达有关，它们之间存在何种联系，有待我们进一步的研究。

综上所述，多西环素可减轻大鼠角膜的浑浊程度，其可能通过减少ECM 蛋白Vim 及Fn 的沉积来减轻碱烧伤大鼠的角膜混浊程度。本次研究为角膜纤维化的机制和多西环素治疗大鼠角膜碱烧伤提供了一定的依据和理论基础。