2-DG抑制糖酵解和线粒体自噬调控M1型巨噬细胞极化*

蓝春花，陈成英，蓝 利，2，王新航，2，常升搏小吉，2，袁江浪，孔星星，陆彩玲，李习艺，唐 深，2△

（广西医科大学 1.基础医学院；2.广西高校基础医学研究重点实验室；3.公共卫生学院，南宁 530021）

2-脱氧-d-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）是一种葡萄糖类似物，可用作葡萄糖代谢的竞争性抑制剂，通过影响细胞的糖代谢发挥调节细胞分化及周期等生物学作用[1-2]，具有抗炎、抗肿瘤等作用。有研究报道，2-DG和脂多糖（LPS）共刺激小鼠腹腔巨噬细胞，抑制己糖激酶（HK）的活性和下调M1分化过程中糖酵解信号通路Glut1 的质子产生率，减少促炎因子的分泌[3]。

巨噬细胞是介导炎症的关键细胞，通过趋化聚集在不同的炎症微环境中，产生高度可塑性并极化诱导适宜的免疫反应有效调控炎症[4]。巨噬细胞极化是一个M1和M2双向的复杂过程，受多种因素调控，巨噬细胞功能状态与其代谢谱密切相关，如M1型巨噬细胞代谢主要以无氧糖酵解和磷酸戊糖途径为主，这利于M1型巨噬细胞清除细菌感染[5]。线粒体是细胞内有氧供能的主要细胞器，可调控细胞多种生理活动，其数量和功能失调会导致细胞内异常的线粒体累积和活性氧（ROS）生成增加，诱导细胞凋亡和坏死[6]；线粒体自噬是细胞清除损伤线粒体，维持线粒体正常功能的主要途径[7]。文献报道，2-DG可诱导细胞自噬从而抑制嗜肺军团菌的生长，有助于提高小鼠巨噬细胞抗嗜肺炎菌感染的保护作用[8]。上述研究提示2-DG 发挥抗炎作用的机制可能是调节巨噬细胞的炎症极化，但具体分子机制仍未明确。本研究以人髓系白血病单核细胞（THP-1）构建体外M1 型巨噬细胞极化模型，初步探讨2-DG 通过糖酵解和线粒体自噬调控M1 型巨噬细胞炎症极化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。2-DG（中国MCE）；佛波酯（PMA，美国Sigma）；干扰素（IFN）-γ（北京Sino-Biological）；RPMI1640 培养液、胎牛血清（美国Gibco）；青霉素、链霉素、LPS、丙酮酸激酶（PK）、HK、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（索莱宝生物技术）；RNA逆转录试剂、TRIzol（日本TaKaRa）；实时荧光定量PCR（qPCR）引物由Invitrogen 公司合成；SYBR®Green Master（美国Roche）；蛋白裂解液、兔抗人微管蛋白（Tubulin）单克隆抗体购自碧云天公司；鼠抗人自噬启动蛋白Beclin-1 抗体、PTEN 诱导激酶1（PINK1）抗体购自Santa Cruz 公司；HRP 标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司。

1.2 细胞培养与分组 THP-1 细胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL 链霉素、100 IU/mL 青霉素的RPMI1640 培养基培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中。按1×106个/孔的细胞密度接种于6 孔板，分为3 组：M0 组（100 nmol/L PMA 刺激48 h 极化为M0 型）、M1 组（M0 组基础上用10 ng/mL LPS 和20 ng/mL IFN-γ共刺激48 h诱导极化为M1型）、M1+2-DG组（M1组基础上加入10 mmol/L 2-DG）。

1.3 qPCR法检测M1型极化相关基因表达 TRIzol提取细胞总mRNA，逆转录为cDNA，用Step One荧光定量PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火10 s，共40 个循环。引物序列如下：β-actin 上游：5’-TCCTCTCCCAAGTCCACACAGG-3，下游：5’-GGGCACGAAGGCTC ATCATTC-3’；白介素（IL）-6 上游：5’-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3’，下游：5’-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3’；肿瘤坏死因子（TNF）-α上游：5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’，下游：5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’；环氧化酶（COX）-2 上游：5’-GCCATGGGGTGGACTTAAATCATA-3’，下游：5’-CAGGGACTTGAGGAGGGTAGATCA-3’；CXC 趋化因子配体10（CXCL-10）上游：5’-TCTCCCATCACTTCCCTACA-3’，下游：5’-CAGGGTCAGAACATCCACTA-3’。以β-actin 为内参，采用2－△△Ct法计算目的基因相对表达量。

1.4 巨噬细胞内糖酵解相关酶（PK、HK、LDH）活性 检测弃去培养基后用预冷的PBS缓冲液洗2遍，每孔加入200 μL HK（PK或LDH）提取液，将细胞刮下并收集于1.5 mL EP 管内，在冰浴条件下超声裂解细胞，4 ℃离心10 min，取上清液。按照试剂说明书检测PK、HK和LDH活性，酶标仪检测吸光值。

1.5 巨噬细胞溶酶体、线粒体荧光信号强度检测按上述实验分组，每组设6个复孔，极化完成后弃上清，加入100 μL/孔荧光探针工作液，置于细胞培养箱 孵育30 min，PBS 洗3 次，加入100 μL/孔Hank’s 溶液，荧光酶标仪检测荧光信号强度（溶酶体荧光信号：激发光525 nm，发射光590 nm；线粒体荧光信号：激发光490 nm，发射光535 nm）。

1.6 Western blotting 法检测巨噬细胞线粒体自噬相关蛋白表达 提取细胞总蛋白，BCA 法蛋白定量；SDS-PAGE 分离蛋白，转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭1 h；一抗置于4 ℃冰箱孵育过夜：Tubulin（1∶2 000）、Beclin-1（1∶1 000）、PINK1（1∶1 000），TBST 洗膜3 次；二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，TBST洗膜3次；暗室中电化学发光法（ECL）显色，凝胶成像系统中曝光。Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.7 细胞内ROS 检测 按上述实验分组，每组设6 个复孔，同时设置阳性对照组（阳性对照试剂为Rosup，于37 ℃培养箱内预处理25 min）；极化完后用PBS 洗3 次，加入DCFH-DA 工作液100 μL/孔，置于细胞培养孵育20 min；PBS洗3次，加入100 μL/孔Hank’s 溶液，荧光酶标仪检测荧光信号强度（激发光490 nm，发射光535 nm）。

1.8 统计学方法 所有数据采用SPSS 23.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSDt检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2-DG 对M1 型巨噬细胞极化相关基因表达的影响 与M0 组相比，M1 组TNF-α、IL-6、CXCL-10和COX-2 mRNA表达升高（均P＜0.01）；与M1组相比，M1+2-DG 组TNF-α、IL-6、CXCL-10 和COX-2 mRNA表达降低（均P＜0.05），见图1。

图1 3 组TNF-α、COX-2、IL-6、CXCL-10 mRNA 表达水平比较

2.2 2-DG 对M1 型巨噬细胞糖酵解相关酶活性的影响 与M0 组相比，M1 组PK、HK 和LDH 活性增加（均P＜0.01），与M1组相比，M1+2-DG组PK、HK和LDH活性降低（P＜0.05，P＜0.01），见图2。

2.3 2-DG 对M1 型巨噬细胞极化过程中线粒体和溶酶体荧光信号的影响 与M0 组相比，M1 组溶酶体的荧光信号增强，线粒体荧光信号减弱（P＜0.01）；与M1组相比，M1+2-DG组溶酶体荧光减弱，线粒体荧光增强（P＜0.01），见图3。

2.4 2-DG 对M1 型巨噬细胞极化过程中线粒体自噬相关蛋白表达和胞内ROS 的影响 与M0 组相比，M1 组胞内ROS 升高，自噬启动蛋白Beclin-1 表达升高，线粒体自噬启动蛋白PINK1的表达也升高（P＜0.05）；与M1 组相比，M1+2-DG 组胞内的ROS降低，Beclin-1 和PINK1 表达均下降（P＜0.05），见图4。

图2 3组巨噬细胞内糖酵解相关酶活性比较

图3 3组巨噬细胞内溶酶体和线粒体荧光强度的比较

图4 3组巨噬细胞胞内ROS产生及线粒体自噬蛋白表达的比较

3 讨论

巨噬细胞是先天免疫系统中最重要的免疫细胞，负责杀伤清除入侵机体的病原体，启动炎症、清除损伤组织和炎症恢复的组织修复。巨噬细胞具有高度可塑性，通过在不同免疫微环境中极化为不同的活化亚群，主要为经典激活的M1 型和交替激活的M2型巨噬细胞，由M1执行杀伤，而M2执行免疫调节和组织修复功能。二者在执行各自特定的功能时均需巨大的能量支持，糖酵解和氧化磷酸化是免疫细胞在免疫应答中产生ATP 的重要代谢途径。线粒体是真核生物细胞内氧化磷酸化供能最重要的场所，对免疫细胞的分化有重要的调控作用[3,9]。

在LPS诱导的急性肺损伤的小鼠模型中，2-DG可显著减轻小鼠肺组织病理损伤，降低促炎因子TNF-α、IL-1β、NLRP3 的基因表达水平[10]。本研究中2-DG 可降低M1型巨噬细胞极化相关基因IL-6、TNF-α、CXCL-10 和COX-2 的mRNA 表达（均P＜0.05），提示2-DG能降低M1型巨噬细胞促炎性因子的表达。有研究报道，2-DG对人血单核细胞来源的巨噬细胞进行预处理后，碱性磷酸钙(BCP)诱导的CXCL-9、CXCL-10、CD40、CD80 和CD86 的表面标记表达显著降低，提示2-DG 可抑制BCP 诱导巨噬细胞的促炎作用[11]，这与本研究结果相似。巨噬细胞极化时，通过糖代谢重新编程以满足不同免疫应答微环境的需求，适应感染和肿瘤等不同性质的炎症中免疫反应过程[12]。在LPS或IL-12刺激下，极化的巨噬细胞代谢主要以无氧糖酵解途径为主[13]。本研究结果显示，巨噬细胞在LPS和IFN-γ刺激下，由M0型极化为M1型后，糖酵解关键酶HK、PK、LDH活性均增加（均P＜0.05），提示细胞内糖酵解水平增加。2-DG 是糖酵解抑制剂，可被HK 磷酸化为2-DG-磷酸，该产物不能进一步代谢，累积的2-DG-磷酸可抑制细胞糖酵解[14]。本实验结果显示2-DG 处理可以抑制M1型巨噬细胞HK、PK和LDH活性，降低M1型巨噬细胞的糖酵解水平，抑制M1型极化基因IL-6、TNF-α、CXCL-10、COX-2基因表达水平（均P＜0.05），这可能是2-DG抑制细胞糖酵解，改变M1型巨噬细胞代谢重编程，负调节M1 极化的重要途径。

线粒体是机体免疫应答的关键角色，在调控巨噬细胞的功能和表型方面起到重要的作用。线粒体荧光探针是一类活细胞内线粒体特异性荧光染料，溶酶体探针是一种带有弱碱性的荧光探针，可以选择性滞留在偏酸性的胞内溶酶体中，特异性标记溶酶体；二者分别能监测巨噬细胞内溶酶体和线粒体活性及数量的动态变化，线粒体自噬是细胞自噬中的一种选择性自噬，可在一系列受体和适配器分子的调控下，对功能性损伤线粒体进行快速协调的清除，主要包括PINK1/Parkin 和线粒体外膜受体介导的线粒体自噬[15]。文献报道小鼠巨噬细胞经LPS诱导分化通过Toll样受体4激活PI3K/AKT/NFκB通路产生大量ROS，进而诱导细胞内自噬及线粒体自噬的发生[16]。本研究结果显示，M0 极化为M1型时，细胞ROS升高，线粒体数量减少，溶酶体增多（均P＜0.05），可能是M1极化过程中胞内ROS引起线粒体损伤，溶酶体融合受损线粒体数量增多，同时检测到M1 极化过程中线粒体自噬相关蛋白Beclin-1、PINK1 的表达明显升高（均P＜0.05），提示LPS和IFN-γ诱导的M1巨噬细胞代谢重编程后，糖酵解增强，伴随细胞内产生大量ROS，功能性损伤线粒体增多，线粒体定位蛋白PINK1聚集在线粒体外膜上募集Pakin进行泛素化增加[17-18]，伴随着自噬特异性Ⅲ类磷脂酰肌醇-3激酶复合物中的Beclin-1增加[19]，进一步促进损伤线粒体与自噬体结合，最终导致线粒体自噬水平增加，细胞内线粒体数量明显降低，巨噬细胞向M1型极化，启动炎症反应。文献报道在敲除转谷氨酰胺酶2(TG2)的小鼠胚胎成纤维细胞和人胚胎肾细胞中，2-DG可以抑制细胞糖酵解活性，缓解羰基氰化物间氯苯腙诱导受损线粒体在细胞累积，促进细胞线粒体自噬[20]。这与本实验研究模型不同，2-DG 干预LPS 和IFN-γ 诱导的M1型极化巨噬细胞后线粒体自噬蛋白Beclin-1 和PINK1 表达明显降低，抑制M1 型极化过程中线粒体自噬（均P＜0.05）。以上结果表明2-DG 在不同的细胞模型中对线粒体自噬的调控不同，提示2-DG对线粒体自噬可能存在多种调控方式。研究发现受损的线粒体功能失调会产生大量ROS，过量的ROS 可以启动线粒体自噬[18]。2-DG 可以激活AMPK 降低球形脂联素诱导小鼠巨噬细胞细胞系RAW 264.7细胞mTOR磷酸化，降低细胞内ROS的产生[21]。结合本研究结果，提示2-DG可能通过抑制细胞内糖酵解，降低LPS和IFN-γ诱导的M1极化过程产生的大量ROS，减轻线粒体的损伤，与溶酶体融合的受损线粒体减少，从而降低线粒体自噬水平，抑制M1型巨噬细胞的炎症极化，防止过度极化造成的炎症反应。

综上所述，2-DG通过抑制M1型巨噬细胞糖酵解水平，引起细胞体内代谢发生重编程，减少ROS生成，减轻线粒体的损伤，降低细胞线粒体自噬水平，抑制促炎性因子分泌，负调控M1型巨噬细胞炎症极化，本研究为2-DG 作为新免疫调节剂治疗炎症性疾病和肿瘤提供新的理论依据。