葡萄种间杂种后代抗寒性评价*

王 荣，乔改霞，檀鹏霞，段 伟，梁振昌，范培格,4

（1 宁夏大学农学院，银川 750021）（2 中国科学院植物研究所）（3 种苗生物工程国家重点实验室）（4 中国葡萄酒产业技术研究院）（5 石家庄农业学校）

葡萄是世界上最重要的经济水果之一，在世界果类产品贸易中占据着重要的位置[1-2]。中国已成为世界上的葡萄生产大国，但由于自然环境因素等的限制，我国还不是世界上的葡萄生产强国[3]。我国北方大部分葡萄产区主要为大陆性季风气候，冬季寒冷干旱，葡萄冻害时有发生[1,4-9]。冻害会严重影响葡萄的生长发育，造成葡萄的品质变劣、产量下降，甚至冻害发生严重的年份，葡萄树整株死亡，造成葡萄园缺苗断垄现象十分普遍[6-7]。生产上常采用埋土防寒的措施来实现葡萄安全越冬，这样不但会大幅度地增加生产成本，还会对葡萄树体造成伤害，而且埋土出土也会造成沙尘现象，加重生态环境恶化[8-10]。因此，进行葡萄抗寒育种，选育出适合我国北方气候条件的高耐寒的葡萄新品种对我国葡萄产业的发展具有重要意义，而对葡萄的杂交后代进行抗寒性鉴定与评价则是抗寒育种的一项重要环节[10-14]。

关于葡萄不同品种的抗寒性鉴定及与抗寒性相关的生理生化指标的研究已有诸多报道[10,13-20]。常用的葡萄抗寒性鉴定方法有田间自然鉴定法、组织变褐法、电导法、恢复生长法、低温放热法以及综合评价法等[10,14,19-20]。其中，低温放热法在植物抗寒性的评价当中已有较多的应用[21-28]，并且在葡萄的抗寒研究中日趋成熟[5-6,28-34]。葡萄一般测定冬芽主芽的LTE 值来评价其抗寒能力的强弱[35]。此外葡萄枝条上芽段萌发率也能很直观地反映出葡萄的抗寒能力，可用来鉴定不同葡萄品种的抗寒性能[36-41]。葡萄组织体内束缚水与自由水所占的比例也与其抗寒性强弱有着密切的关系[12,19,41-44]。因此，将束缚水与自由水的比值作为评价葡萄抗寒性的指标是较可靠的，但是仅用单一的指标难以客观准确地反映出不同品种的抗寒能力，所以试验中经常会采用多种鉴定方法或多个与抗寒性相关的理化指标，结合隶属函数法、主成分分析法等多种统计方法来综合评价不同品种的抗寒性[13-14,36,45-47]。

本研究对露地越冬且经过冬季田间自然低温胁迫后的杂交后代及其亲本，测定其枝条总含水量、自由水及冬芽LTE 值、萌芽率，并应用隶属函数法综合评价种间杂交后代的抗寒性，以筛选出高抗寒的优良杂种单株，为进一步选育高抗寒的优良葡萄品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为中国科学院植物研究所葡萄种质资源圃（北京）中保存的145 株‘北红’×7-11-49杂交后代，以母本‘北红’（Vitis vinifera‘Muscat Hamburg’ ×V.amurensis）和父本 7-11-49｛［Minnesota78（V.labrusca‘Beta’×Witt）×V.riparia］×V.vinifera‘Chenin Blanc’｝为对照。试验材料全部不埋土露地越冬。2020 年1 月15 日左右，挑选长势一致的葡萄枝条，从第三节间剪下葡萄枝条，每个杂种单株剪5 根枝条，用保鲜膜包裹，做好标记后置于4 ℃的冷库中临时保存。

1.2 试验仪器

电子天平；电热鼓风干燥箱；数显糖度计（APS90）；DTA 系统由程序控制冰箱（T2C）和数据采集系统（2700-DAQ-40）2 部分组成。程序控制冰箱模拟自然降温。数据采集系统有4 层PVC 板，每层PVC 板上有9 个电热模块，每个PVC 板均配置热敏电阻式温度传感器，记录芽体放热过程中每个热电模块中温度的变化，并将其转换成电压（mV）形式输出。数据采集器每隔15 s 采集1 次从温敏电阻及热电模块中传出的电阻及电压变动数据，电阻值（R）经由公式转换为样品盘的实时温度［T（℃）=-0.007 742×R+106.5］，结合Excel LINX 程序，在Excel 中完成响应温度下的电压变动图[10]。

1.3 试验方法

1.3.1 枝条总含水量的测定

测定方法参照邹琦的烘干法[48]。将保存的1 年生成熟枝条剪截成长5～8 cm 的不含芽枝段，枝段每3 段为1 组进行逐一编号，每个单株重复5 组，精确称重，记为Wf（组织鲜重）；然后将其置于烘箱中，在105 ℃烘30 min 杀青，之后再置于80 ℃烘至恒重，称其重量记为Wd（组织干重）。

枝条总含水量（%）＝［（Wf－Wd）/Wf］×100

1.3.2 枝条自由水及束缚水的测定

自由水测定参照潘瑞炽的方法[49]。取出10 mL型号的离心管，逐一编号，并将空离心管放在天平上准确称重，记录为W1，将枝条避开芽眼用刀片切成0.1 cm 厚的薄片，每个重复准确称取0.5 g，放入对应试管称量，记录为W2，将配好的65%蔗糖迅速加入每个离心管中，每管加5 mL，再称重记录为W3，塞紧试管，以免水分散失，置于暗处放置6～8 h，其间不时轻轻摇动，用数显糖度计测定各试管蔗糖溶液浓度，每个单株重复5 次。

枝条自由水含量（%）=｛（W3－W2）×［（C1－C2）/C2］/（W2－W1）｝×100

式中：W2－W1为枝条鲜重（g）；W3－W2为糖液原重量（g）；C1为糖液原浓度（%）；C2为浸泡后糖液浓度（%）。

枝条束缚水含量（%）=枝条总含水量－枝条自由水含量

束自比=束缚水含量/自由水含量

1.3.3 葡萄冬芽LTE 的测定

测定方法参照柴风梅等的报道[50-51]。取芽位置为4～8 节位，并且选择饱满的芽体，垂直芽体中轴线下刀，仅带0.5～1.0 mm 厚的木质部组织，切面平整。将切好的芽体放入有潮湿吸水纸的培养皿中。在电热模块中放好薄纸片，加入150 μL dH2O，每个电热模块中放入6 个芽体，每个单株重复放3个电热模块，芽切面向下。盖上海绵，轻压使切面与电热模块紧密接触。将固定好的PVC 板置于程序控制冰箱降温，降温程序为：室温至-4 ℃，30 min；-4 ℃保持1 h；-4 ℃至-40 ℃，降温速度4 ℃/h，共需10 h；-40 ℃保持1 h；45 min 内升温至4 ℃。数据采集系统每隔15 s 采集1 次温度数据，芽的致死温度为低温放热高峰出现时所对应的气候室温度值。

1.3.4 枝条萌芽率试验

测定方法参照乔改霞等的报道[41]。取经过低温胁迫的枝条，剪切成含1 个冬芽的枝段，将剪好的枝段插入泡沫板中，并置于装有自来水的塑料盒中，随后放入光照培养室进行培养。在光照强度为2 000～3 000 lx 的灯管下培养12 h，黑暗培养12 h，温度为25 ℃左右。每个单株做3 次重复，每个重复5 个芽。

萌芽率（%）=（萌发枝数/总扦插枝数）×100

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 软件进行数据整理，用SPSS 19.0 统计软件对数据进行方差分析，用Excel、R 软件作图。参照张文娥等[46]的方法，采用隶属函数法求各指标的隶属度，并计算平均隶属度。按照平均隶属度将抗寒性分为5 级：0.70～1.00 为高抗（HR），0.60～0.69 为抗（R），0.40～0.59 为中抗（MR），0.30～0.39 为低抗（LR），0～0.29 为不抗（S）。

变异系数（%）=（组合F1代平均隶属度标准差/组合F1代隶属度的平均值）×100

超低亲率（%）=（平均隶属度低于较低亲本的F1代株数/组合F1代总株数）×100

超高亲率（%）=（平均隶属度高于较高亲本的F1代株数/组合F1代总株数）×100

遗传传递力（%）=（组合F1代隶属度的平均值/亲本隶属度平均值）×100

2 结果与分析

2.1 不同单株冬芽的LTE 图

由图1 可以看出，每个电热模块有6 个冬芽，基本对应着6 个LTE 高峰。杂交后代不同单株其冬芽出现LTE 高峰时所对应的温度范围不同，同一单株不同节位的冬芽的LTE 高峰也略有差异，但分布较为集中。

2.2 杂交后代不同指标的比较分析

由图2 可以看出，亲本及杂交后代枝条总含水量大多在47%左右，大致呈水平分布。自由水、束缚水含量及束自比、LTE 值大致呈线性分布，并且比较它们与萌芽率的关系可以发现，当枝条芽眼萌发率为100%时，枝条组织内束缚水所占比率高，自由水所占比率低，束自比值高，LTE 值低，并且大部分都在-20 ℃以下；当萌芽率降低时，枝条组织内自由水所占的比率变高，束缚水所占比率降低，束自比值低，LTE 值升高。这说明抗寒能力差的单株其枝条组织内自由水所占比率高、束缚水所占比率低，束自比值低，LTE 值高。

2.3 杂交后代抗寒性的遗传分析

亲本‘北红’和7-11-49 的平均隶属度分别为0.58、0.42，其抗寒性等级均属于中抗。杂交F1代出现了抗寒性分离，其平均隶属度分布在0.16～0.93，杂交后代表现出不同程度的抗寒性，并且存在超亲遗传现象。其中，超过高值亲本‘北红’的有78 株，超高亲率为53.8%；低于低值亲本7-11-49 的有29 株，超低亲率为20.0%；介于2 个亲本之间的有38 株，所占比率为26.2%，变异系数为28.52%，遗传传递力为116.0%。说明该杂交组合抗寒传递能力强，且具有抗性能力增强的倾向。

2.4 不同抗性下同一指标的比较分析

图1 4 个单株冬芽的LTE 图

图2 亲本及杂交后代各指标的平均值分布

图3 不同抗性等级下同一指标的范围值

由图3 可以看出，杂交后代中不同抗性单株间各指标值存在显著差异。除自由水含量这一指标外，其余几项指标变化趋势大体一致，随着抗性等级递减其各指标的绝对值在变小。高抗及抗的杂种单株枝条的总含水量显著高于其他3 个级别，其值分布在44.0%～52.0%；不抗的显著低于其他各个抗性等级，其值为42.6%～47.2%；中抗和低抗之间则无显著性差异。在自由水含量方面，高抗的杂种单株枝条自由水含量显著低于抗、中抗、低抗以及不抗的单株，其含量大致分布在14.0%～23.0%；低抗和不抗的单株自由水含量显著高于其他抗性单株，其值为22.3%～33.0%；表现中抗的显著高于表现抗性的单株，其值分布在19.6%～27.0%。在束缚水含量方面，高抗的显著大于其他几个，其值分布在27.8%～34.0%，并且随着抗性的降低其值也在显著地减小，表现不抗的最低，其值为15.4%～20.0%。束自比方面，其比值变化同束缚水含量变化一致，高抗的比值为1.2～2.2，中抗的为0.8～1.2，不抗的为0.5～0.8。从LTE 方面来看，高抗的单株冬芽LTE值显著低于其他抗性单株，其最低值为-27.74 ℃，分布在-27.8～-23.2 ℃；不抗与低抗的无显著差异，但显著大于其他抗性单株，其最低值为-18.76 ℃，分布在-19.0～-15.9 ℃；中抗的LTE 值显著大于抗性的，二者的范围值分别为-23.0～-18.6、-25.0～-21.7 ℃。在萌芽率方面，不抗的显著低于其他抗性单株，其值在26.0%～69.0%；低抗的显著高于不抗的，但显著低于高抗、抗以及中抗的，其值分布在60.0%～81.1%；高抗、抗以及中抗的单株间萌芽率无显著性差异，且都全部萌芽。

2.5 不同指标之间的相关性分析

由图4 可以看出，LTE 与束缚水、束自比及萌芽率之间皆具有显著的负相关关系，相关系数分别为-0.90、-0.91、-0.72；LTE 与自由水显著正相关，相关系数达0.84。自由水与束缚水、束自比之间有显著的负相关性，相关系数分别为-0.80、-0.93，而束缚水与束自比之间有显著的正相关性，相关系数为0.93；总含水量与自由水、萌芽率之间无显著相关关系，与LTE、束缚水及束自比之间有显著相关关系，但相关系数都很低，均在0.50 以下；萌芽率与自由水、束缚水、束自比及LTE 之间皆有显著的相关关系，相关系数分别为-0.79、0.75、0.72、-0.72，相关系数均较高，所以束缚水、自由水、束自比、LTE 可以作为评价葡萄抗寒性的指标。

3 讨论与结论

图4 不同指标间的相关关系

抗性育种主要是利用高抗性的野生资源与优质的栽培品种杂交进行品种选育，使新品种既获得野生资源中的重要抗性基因又能拥有栽培品种的优良品质[10]。为了选育出品质优良且抗寒性强的葡萄品种，育种家们利用高抗寒性的野生葡萄资源与品质优良的欧亚种进行杂交，获得具有强抗寒性且优质的种间杂种。‘北红’是含有山葡萄血脉的杂交品种，其在我国北方大部分葡萄产区均可露地越冬[52]；7-11-49 是含有美洲葡萄（Vitis labruscaL.）和河岸葡萄（Vitis riparisMichx）血统的杂交品种，而美洲葡萄和河岸葡萄是抗寒性仅次于山葡萄的优良野生资源[29,53]。2 个亲本皆是抗寒性较强的品种，其杂交后代出现了抗寒性状分离以及超亲遗传现象，且抗寒性遗传偏向抗性增强的方向，这与柴风梅等[10,51]的研究结果一致。

葡萄抗寒锻炼过程中会发生一系列复杂的生理代谢活动来适应低温环境，而这些生理代谢活动都是在水的参与下完成的。一般而言，植物组织内自由水所占比率越高，则植物体内的代谢活动越强，表现出生长较快，但其抗逆境胁迫能力较弱，而当束缚水所占比率越高时，植物体内的代谢活动相应变弱，表现出生长慢，但其抗逆境胁迫能力却得到增强。因此，植物组织中束缚水与自由水所占的比率能较准确地反映植物抗寒性的强弱[43-45]。本研究也发现，抗寒性强的单株其枝条内束缚水含量高，自由水含量较低，束自比值高，而抗寒性弱的结果相反，这与陈佰鸿等[44]的研究结果一致。

通常，植物组织中自由水的冰点大致在0 ℃左右，束缚水却能够在-25～-20 ℃下保持不结冰。自由水在低温状态下易结冰导致细胞脱水死亡或者在细胞内部形成冰晶损伤细胞膜系统，造成植物抗寒性下降[44-45]。因此，当植物组织中束缚水所占比率高时，植物组织的冰点就会相应地降低，以此来提高植物的抗寒能力。本研究结果也表明，LTE 值与葡萄组织中束缚水和自由水的含量有着密切的关系。另外，用低温放热法来分析葡萄不同品种冬芽抗寒性强弱的过程中，应注意在冬芽抗寒锻炼完成或抗寒性能稳定时取样，保存温度也要适宜，以免造成脱锻炼现象。测定时也要注意葡萄冬芽的削取，削芽片时，既要保持芽（尤其是主芽原基）完整，又不能带过多的节间组织，同时要做到削面平整、芽鳞完好，削后放置在有湿滤纸的培养皿中，之后样品准备好后立即进行LTE 检测[34]。

另外，通过田间观察发现，部分抗寒性强的单株其春季田间葡萄萌芽力低，并且有2～3 个单株的枝条出现干枯皱死现象，这可能是由于我国北方大部分地区冬季不仅严寒，而且干旱少雪，大气相对湿度低，葡萄植株容易丧失水分，从而引起枝条干枯皱死。此外，冬末初春时气温变幅大，北京及周边地区，大风天气频繁发生，加快了枝条水分的散失，土壤解冻迟，升温快，而根部不能及时从土壤中吸收水分来供应树体，致使地上部生理干旱而枯死[5,9,30,41,51,54]。因此，选育出能够适应我国北方冬季寒冷干旱气候，实现越冬期间免埋土栽培的葡萄品种，需要其不仅抗寒性能强，而且还要有抗干旱的能力[10,51]。

本试验利用低温放热法、恢复生长法以及测定自由水与束缚水，从杂交后代中选出38 株抗寒性强的单株；同时也可以看出，LTE 值、束缚水和自由水的比值与抗寒性的强弱有着密切的关系，可作为葡萄抗寒性鉴定的重要指标。