血清Dickkopf-1蛋白检测在活动性强直性脊柱炎中的应用

胡佳琳 郝喆 杨颖莹 王丹 曾昆

强直性脊柱炎(AS)是一种常见于青少年、以中轴关节的慢性炎症为主的血清阴性脊柱关节病，主要累及的部位是骶髂关节、髋关节及脊柱[1]。随病情进行性加重，累及脊柱者出现脊柱强直和功能丧失。而导致AS脊柱僵硬和丧失活动能力的主要病理改变为关节炎症和新骨形成[2]。既往研究发现，Wnt信号是AS新骨形成的关键因素，通过强化Wnt信号途径，抑制天然抑制物Dickkopf-1蛋白(DKK-1)的表达，可导致外周骨赘的过度增生；无骨赘形成患者的DKK-l水平较有骨赘形成患者明显升高[3-4]。DKK-1是一种分泌型糖蛋白，主要通过与相应的受体结合，阻断Wnt信号的传导，从而抑制细胞的增殖和骨形成。尽管AS的病因不明，但近年来，发现肿瘤坏死因子(TNF)-α在多种自身免疫性疾病患者的血清中呈高表达，白细胞介素(IL)-6也在AS的发病中发挥了一定的作用，表明细胞因子TNF-α和IL-6与AS的发病相关。强直性脊柱炎疾病活动指数(BASDAI)评分为评价AS疾病活动度的有效指标[5]。红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)是典型的两种急性时相反应物，用于评估AS患者的炎症状况。我们通过检测活动性AS患者血清DKK-l水平，探讨其与活动性AS的关系。

对象与方法

1.对象：2016年12月～2018年6月于我院风湿免疫科确诊及治疗的活动性AS患者50例(AS组)。纳入标准：(1)18～60岁；(2)符合1984年修订的纽约标准[6]，且BASDAI评分≥4分，符合活动性AS标准；(3)能充分合作。排除标准:(1)严重心脏、脑、肾脏、肝脏等重要器官及内分泌、血液系统及神经系统疾病病史；(2)急、慢性感染,包括泌尿系统、心脏、肺脏、耳、鼻、咽喉等感染；(3)活动性结核病病史；(4)其他风湿性疾病及恶性肿瘤；(5)妊娠期和哺乳期。另选取同期于我院体检的健康者50例(对照组)。其中AS组男35例，女15例，年龄20～53岁，平均年龄(34.68±9.56)岁，平均症状持续时间(3.74±1.82)年，人白细胞抗原(HLA)-B27阳性37例(74.0%)；对照组男33例，女17例，年龄19～52岁，平均年龄(33.02±8.18)岁，两组受试者性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。所有受试者均自愿参加，并签署知情同意书。

2.方法：AS组患者均接受非甾体抗炎药和(或)传统改善病情的抗风湿药和(或)TNF-α抑制剂治疗，并接受随访6个月。两组受试者均空腹采集静脉血10 ml，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DKK-l、IL-6及TNF-α水平。采用散射比浊法检测CRP和ESR水平。

结 果

1.对照组和AS组受试者实验室检查结果比较：AS组受试者血清DKK-l水平低于对照组，血清IL-6、TNF-α、ESR及CRP水平均高于对照组(P<0.001)。见表1。

表1 对照组和AS组受试者实验室检查结果比较

2.AS组患者治疗前后实验室检查结果及疾病活动度比较：AS组患者治疗6个月后血清TNF-α、ESR、CRP水平及BASDI评分均低于治疗前(P<0.001)，而治疗前后血清DKK-1及IL-6水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 AS组患者治疗前后实验室检查结果及疾病活动度比较

3.AS患者血清DKK-l水平与BASDAI评分、ESR、CRP、IL-6、TNF-α的相关性分析：Pearson相关分析结果显示，AS患者血清DKK-l水平与BASDAI评分、ESR、CRP、IL-6及TNF-α均无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 AS患者血清DKK-l水平与BASDAI评分、ESR、CRP、IL-6、TNF-α的相关性分析

讨 论

AS是风湿性疾病中最常见的具有致残性的慢性炎症性疾病之一，致残的主要原因是脊柱的过度骨化和新骨形成，晚期脊柱出现“竹节样”改变，最终导致脊柱强直和功能丧失，严重影响患者的自理能力，给个人、家庭及社会带来沉重的负担。研究表明，成骨细胞的增殖、分化及成熟是通过经典Wnt信号通路完成,而DKK-1作为抑制骨形成相关通路的一项关键性因子,在抑制Wnt信号通路中发挥重要作用[7]。而新近的研究发现，Wnt信号通路可能参与了AS骨赘的形成[8-9]。

既往研究结果显示，DKK-1与AS发病过程密切相关[10]。在成骨细胞中发现过表达的DKK-1蛋白也证实这一点，通过观察以Col1A1 2.3 kb和Col1A1 3.6 kb为启动子的DKK-1过表达转基因的小鼠，发现其出现严重的骨量缺失，血清骨钙素浓度降低5%，成骨细胞数量降低49%；此外，从体外实验中还发现Dkk-1蛋白抑制成骨细胞矿化结节的形成呈剂量依赖性；相反，存在DKK-1蛋白缺陷的杂合子小鼠的成骨细胞数量及骨形成率均明显高于野生型小鼠[11-13]。也有研究报道了AS患者血清DKK-1水平明显降低[14]。DKK-1蛋白能通过干扰Wnt蛋白的结合而阻断Wnt通路，从而减少骨形成。本研究也发现，AS组患者血清DKK-1水平低于对照组，表明DKK-1与AS具有相关性。

细胞因子的网络调节异常是AS发病机制的一个重要特征，其中IL-6调节网络参与AS的病理生理过程。多项研究结果显示，AS患者血清和滑膜组织IL-6水平均高于健康对照组[15-17]。本研究中，AS组患者血清IL-6和TNF-α水平均高于对照组，且AS组患者治疗6个月后TNF-α水平低于治疗前，而AS组患者治疗前后血清DKK-1水平比较差异无统计学意义。同时Pearson相关分析结果显示，血清DKK-1水平与IL-6及TNF-α均无相关性，表明调节IL-6和TNF-α水平均不能达到调控DKK-1水平的作用。ESR、CRP水平及BASDI评分均能提示AS患者体内炎症情况，反映AS疾病的活动度，但本研究发现，AS组患者治疗6个月后血清ESR、CRP水平及BASDI评分均低于治疗前，而AS组患者治疗前后血清DKK-1水平比较差异无统计学意义，同时血清DKK-1水平与BASDI评分、ESR及CRP均无相关性，提示DKK-1可能与AS疾病活动度无关。由此推断，降低AS患者疾病活动度可能不能达到调控DKK-1水平的作用。但由于本研究观察时间短，样本量亦偏少，仍需进一步探讨。李振彬等[18]的研究结果显示，AS患者存在骨破坏/新骨形成与炎症因子水平升高的分离现象。炎症不是新骨形成的直接后果，这可能是导致不同患者结局不同的原因之一[19-20]。研究表明，通过阻断DKK-l蛋白上调Wnt信号通路，可抑制骨破坏，促进骨形成[3]，而DKK-1高表达可抑制AS的新骨形成[4]，表明或许可通过提高血清DKK-l水平而达到抑制新骨形成的作用。但本研究结果显示，血清DKK-l水平与疾病活动度及实验室炎症指标均不相关，提示血清DKK-l调控可能并不受炎症影响，AS新骨形成的过程与疾病炎症活动可能是相对独立的两个过程。

Walter等[21]发现脊柱炎症的存在更容易导致韧带骨赘形成，但不存在炎症的脊柱同样会出现骨赘形成，且炎症的消失对骨赘的形成无任何抑制现象。本研究结果显示，控制炎症、阻断致病细胞因子TNF-α、IL-6均不能达到调控AS患者血清DKK-l水平的作用。综上所述，血清DKK-1水平与AS发病过程相关,但与AS疾病活动度无明显关系。DDK-1与AS之间的关系仍需进一步深入研究，或许能进一步明确AS新骨形成的病理生理过程，为AS的疾病评估提供新的生物标志物及为治疗靶点。