噬菌体防控水产品中细菌生物膜污染的研究进展

李 萌，马永生，李 莹，赵前程

( 1.大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023; 2.辽宁省水产品分析检验及加工技术科技服务中心，辽宁 大连 116023; 3.大连工业大学，海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034 )

我国2018年水产品总产量达到6.457 66×107t，水产品人均占有量达到46.28 kg[1]。随着水产品消费量的提高，由细菌引发的水产品安全问题频繁发生[2]。98%以上的细菌会黏附于有生命或无生命物体表面后，产生大量的多糖、脂类等多聚物基质包裹在自身菌体外，形成细菌生物膜保护细菌在恶劣条件下生存并转移到新环境，加速细菌的交叉污染[3]。由于细菌生物膜结构的复杂性，在水产品加工过程中经清洗消毒工序仍难以有效清除，因此，控制水产品中细菌，特别是防控其形成的生物膜交叉污染食品，是控制水产品中食源性疾病发生的关键，也是保障食品安全的重要途径之一。

噬菌体，作为一类生物抑菌剂，在自然界中分布广泛，能够专一性裂解宿主细菌，普遍认为对人体、动植物均无害[4]。目前国外已有针对食源性致病菌大肠杆菌(Escherichiacoli)、李斯特菌(Listeria)和沙门氏菌(Salmonella)的商品化噬菌体制剂[5-6]。同时，噬菌体编码的内溶素和胞外多糖裂解酶也能有效清除特定的食源性细菌生物膜[7-8]。国内外针对食品工业中的细菌生物膜污染问题进行了深入研究，并针对噬菌体及其裂解酶对医学领域的细菌生物被膜抑制效果进行了探讨分析[9-12]。然而，仍缺少针对水产品中常见细菌生物膜的污染问题及相关噬菌体防控作用的研究分析，因此笔者针对噬菌体在水产品中细菌生物膜作用的研究进展进行了综述。

1 水产品中细菌生物膜的形成及调控

不同种类的细菌、真菌、病毒和寄生虫均会导致水产品食源性疾病，而由细菌污染和细菌毒素残留引起的水产品食用安全问题占据较大比例。霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnficus)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、沙门氏菌和单增李斯特菌(L.monocytogenes)等为引起水产品污染几率较多的食源性致病菌[13]。另外，水产品由于富含营养物质和水分，在贮藏过程中也容易受到腐败微生物污染导致腐败变质，希瓦氏菌属(Shewanella)中的腐败希瓦氏菌(S.putrefaciens)、波罗的海希瓦氏菌(S.baltica)以及假单胞菌属(Pseudomonas)中的荧光假单胞菌(P.fluorescens)、恶臭假单胞菌(P.putida)等为有氧冷藏水产品中常见的优势腐败菌[14]。这些水产品中常见的致病菌和优势腐败菌均会在水产品、加工接触面和水环境中形成生物膜(表1)。

1.1 常见食源性致病菌——弧菌属

弧菌特别是霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌在世界范围内是水产品，尤其是双壳类软体动物等滤食性动物中的常见致病菌，引起的水产品食源性疾病是许多国家面临的公共卫生问题。

霍乱弧菌广泛存在于河海口，产霍乱毒素的O1群和O139群菌株，会引起严重的腹泻病从而引发霍乱的流行。霍乱弧菌能够在浮游植物、浮游动物、贝类等水产品以及食品加工厂不锈钢等接触面生成生物膜[15]。霍乱弧菌群体感应系统(QS)通过抑制霍乱弧菌多糖(VPS)的生物合成对生物膜形成起到负调控作用，而3′,5′-环双鸟苷酸(c-di-GMP)信号分子可通过促进霍乱弧菌多糖的生长，促进生物膜的形成[16]。另外，环磷腺苷—受体蛋白(cAMP-CRP)会抑制霍乱弧菌多糖的合成以及生物膜基质中蛋白质的合成，抑制生物膜的形成[17]。

表1 水产品中细菌生物膜形成情况Tab.1 Summary of research on biofilm of foodborne and spoilage bacteria from fishery products

副溶血弧菌在水产品流通过程中容易产生交叉污染，导致肠胃炎甚至引发败血症[40]。它能够在硅藻形成的甲壳素，长牡蛎、大黄鱼或其他来源的几丁质表面形成生物膜[18-21]。副溶血弧菌生物膜的形成机制与霍乱弧菌一致，受群体感应系统和3′,5′-环双鸟苷酸信号通路的调节。副溶血弧菌生物膜形成能力与细菌本身的细胞表面疏水性、自诱导因子(AI-2)生成量和蛋白酶活力呈正相关性[41]。Chung等[42]发现，编码oxyR突变菌株生物膜生成量明显低于野生菌株。黄倩等[43]研究表明，AphA蛋白能通过间接抑制scrABC和scrG基因的转录表达而促进3′,5′-环双鸟苷酸的合成，进而促进副溶血弧菌生物膜形成。

创伤弧菌在世界范围内的温暖沿海水域和河口均有存在，且会污染蟹类、牡蛎、虾类、蛤蜊和鱼类等水产品[44-46]。Joseph等[22]的研究表明，创伤弧菌能够在塑料、玻璃管和玻璃盖玻片表面形成生物膜。创伤弧菌产生的荚膜多糖(CPS)、金属蛋白酶(VVP)、脂多糖(LPS)和胞外多糖(EPS)等均与细菌的毒性作用密切相关，并对生物膜的生成具有一定的影响。有研究表明，荚膜多糖的表达会影响创伤弧菌在接触物表面的吸附并抑制生物膜的形成[47]；创伤弧菌的2种群体感应系统——LuxS/AI-2和smcR基因均对金属蛋白酶的表达具有调控作用[23-24]；Kim等[25]发现，创伤弧菌编码的蛋白NtrC能够通过调控脂多糖和胞外多糖的生物合成，进而调节生物膜的生成。Park等[26]对牡蛎表面的创伤弧菌生物膜形成能力进行了相关研究，结果发现，细菌胞外基质蛋白CabA能够有效促进生物膜的形成。

1.2 常见食源性致病菌——沙门氏菌属

沙门氏菌属肠杆菌科细菌，致病能力强，会引起非伤寒沙门氏菌感染症如急性肠胃炎，或是伤寒等烈性传染病，是一种重要的食源性致病菌，在食品生产线的加工接触面中均能检测到其生物膜的存在，并引发多起水产品中毒事件[9]。沙门氏菌生物膜在不同的食品加工接触面如不锈钢、玻璃、铝箔、聚乙烯和聚氟乙烯均存在不同程度的转移率[31]。沙门氏菌生物膜能够提高细菌对加热、干燥、消毒剂和抗生素等外界环境的耐受能力，如Vestby等[32]对鱼饲料厂和养殖厂分离的沙门氏菌生物膜形成能力的分析发现，在自然环境中耐受力越强的菌株，其形成生物膜的能力越强。沙门氏菌生物膜的调控机制非常精密复杂，生物膜生成受细胞间信号传导系统中3′,5′-环双鸟苷酸信号分子，群体感应系统，基因调控系统如CsgD因子、RpoS因子、Crl因子、外膜蛋白OmpR、IHF因子、H-NS蛋白、CpxR系统、MlrA调节因子、Csr系统、BarA/SirA以及PhoPQ-RstA双组分系统等的影响[33]。

1.3 其他常见食源性致病菌

1.3.1 嗜水气单胞菌

嗜水气单胞菌属气单胞菌属，为一种典型的人畜共患病原菌。在水产品批发市场未经加工的新鲜海鲜、虾类或即食类水产品中，或在海水、淡水和污水环境中均检测到嗜水气单胞菌[48]。目前尚无嗜水气单胞菌在水产品表面吸附形成生物膜的报告，但有研究表明，它能够在不锈钢、玻璃和生菜表面形成生物膜[27-29]。毛秀秀等[30]研究发现，致病性嗜水气单胞菌能够在聚苯乙烯酶标板表面形成生物膜，且Cyt c4和MshQ基因与该菌的成膜性相关；同时，Jahid等[49]的研究表明，嗜水气单胞菌生物膜的形成受培养条件中葡萄糖浓度的调节。

1.3.2 单增李斯特菌

单增李斯特菌是一类常见的食源性致病菌，分布广泛，在低温条件下仍可生长繁殖，并已在淡水鱼和蟹类等水产品原料以及熏鱼，即食生鲜，虾、贝类等水产加工产品中被检出[50-51]。Takahashi等[52]研究表明，从即食水产品中分离的单增李斯特菌可形成生物膜。它可黏附在塑料和不锈钢表面形成生物膜[34-35]。同时，常见的紫外线处理、干燥和消毒剂难以去除该类细菌的生物膜[53]。单增李斯特菌的生物膜与其致病性和耐药性密切相关，影响其生物膜形成的关键因子有鞭毛糖蛋白，胞外DNA，胞外多糖，胞外结合蛋白和寡肽介导的Agr群体感应系统等[36]。

1.4 常见优势腐败菌

1.4.1 希瓦氏菌属

希瓦氏菌能够产生硫化物、胺类物质以及引起鱼臭味的特征物质三甲胺，其中腐败希瓦氏菌和波罗的海希瓦氏菌是海洋水产品中的优势腐败菌。腐败希瓦氏菌对营养条件需求低，可在加工厂接触面形成纤维状生物膜，并由于代谢产生的硫化物和铁离子可对不锈钢接触面造成微生物诱导的腐败现象，致使食品交叉污染的机会增多[37]。刘娜娜[38]研究表明，波罗的海希瓦氏菌可在玻璃片上黏附形成生物膜，且形成能力受群体感应系统信号分子DPKs的影响。

1.4.2 假单胞菌属

假单胞菌广泛分布在土壤、水、食品加工厂环境中，会代谢产生大量醛、酮、酯和有异味的挥发性产物。假单胞菌属在不同类型的介质表面均容易形成生物膜，且受群体感应系统和3′,5′-环双鸟苷酸信号通路的调节影响[39]。假单胞菌属中的荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌为水产品中常见的优势腐败菌，不仅自身具有较强的生物膜生成能力，同时能够显著提高致病菌生物膜的定殖黏附能力[54]。

2 噬菌体防控水产品中细菌生物膜的应用

2.1 作用机制

噬菌体为细菌病毒，根据感染裂解细菌的方式被分为烈性和溶源性。烈性噬菌体的生长繁殖见图1a。吸附和裂解为烈性噬菌体生长繁殖过程中的关键阶段，保证噬菌体能够将自身遗传物质注入到宿主体内感染细菌，并在最后阶段成功释放出子代噬菌体。在这“一进一出”的过程中，细菌生物膜成为第一道屏障，部分噬菌体会编码裂解胞外多糖的多糖降解酶，有效降解生物膜(图1b)[55]。烈性噬菌体在裂解细菌后期编码释放的一类蛋白质，具有裂解细菌细胞壁，降解生物膜的作用，此类裂解酶又称为内溶素(图1c)。根据作用于细胞壁共价键位点的不同，噬菌体独立进化出了至少4种不同内溶素，其中3类为水解酶，1类为糖基转移酶[56]。因此，利用噬菌体及其编码的裂解酶对细菌及其胞外多糖进行降解，达到消除或减少生物膜的目的。

图1 烈性噬菌体及其编码的主要裂解酶Fig.1 The lytic bacteriophage and phage-derived lyasea.烈性噬菌体生长繁殖过程； b.噬菌体吸附阶段降解生物膜的多糖降解酶； c.噬菌体裂解阶段降解革兰氏阳性细菌细胞壁的内溶素.a.lytic life cycle of phages; b.polysaccharide depolymerase degrading the biofilm during the adsorption of the phage particle; c.structure of gram-positive bacteria cell wall and role of the endolysin during the bacteria lysis.

2.2 应用现状

在食品加工过程中，交叉污染尤其是固体食品与食品加工接触面之间的接触污染(SFC)是食品工业中污染率最高的污染途径[57]。因此，噬菌体及其裂解酶对水产品中细菌生物膜的抑制研究多以常见的食品加工接触面材质为基础。已有的研究表明，单一的噬菌体或噬菌体混合液对食品加工接触表面上致病菌和腐败菌形成的生物膜均有一定的消除或抑制生长效果(表2)。

在医学领域，噬菌体编码的裂解酶能够有效地消除致病菌如猪链球菌(Streptococcussuis)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等形成的生物膜[73-75]。Oliveira等[63]研究发现，鼠伤寒沙门氏菌噬菌体编码的内溶素Lys68对聚丙烯塑料表面生物膜中细菌的清除率可达99%。Cornelissen等[72]发现，恶臭假单胞菌噬菌体φ15编码的尾部蛋白具有多糖裂解酶的活性，当φ15和尾部蛋白共同作用时对恶臭假单胞菌生物被膜的消除率约为37%，相同情况下单独使用尾部蛋白无显著消除生物膜效果。

表2 利用噬菌体及其裂解酶消除水产品中细菌生物膜的特性Tab.2 Application of bacteriophage and phage lyase in biofilm removal of bacteria in fishery product

2.3 应用尚需解决的问题

噬菌体的高度专一性以及细菌的多样性和易产生抗性的特点，会导致噬菌体的抑菌性能降低[76]。水产品加工过程的清洗消毒工序诸如高温、高压、紫外线、pH、化学消毒剂等外界条件会对噬菌体制剂清除生物膜的效果产生影响。因此，商品化的噬菌体制剂多采用噬菌体混合液的方式，既解决单一噬菌体裂解谱较窄的问题，也降低目标菌株产生抗性的概率。开发可耐受外界环境的噬菌体或内溶素，如内溶素Lys68可在高温条件下裂解沙门氏菌生物膜[63]。采用蔗糖等保护剂和微胶囊化技术对噬菌体进行有效保护，减缓加工过程中的严苛条件对其裂解性能的影响[77]。

噬菌体制剂的制备和安全检测方法均较为成熟，可采用无致病性的菌株作为宿主菌，发酵扩增噬菌体，并通过离子交换和超滤膜过滤等技术去除溶液中的细菌碎片或其他杂质[78]。目前，已有去除噬菌体溶液中内毒素的成熟方法，并有商品化的试剂盒可用于检测噬菌体溶液中的内毒素成分[79]。然而，噬菌体裂解酶多以重组表达的形式获得，该类方法成本高，得率低，目前进行商品化的难度较大。同时仍需要对实际应用过程中的噬菌体或裂解酶进行风险评估，以确保其食用安全性。此外，国内尚未有针对噬菌体生物制剂生产使用相关的法规，消费者对此类产品的态度也并不容乐观[80]。

3 展 望

食源性致病菌和腐败菌在水产品加工接触面，非加工接触面(如下水道、墙壁等)以及牡蛎、虾、蟹等水产品表面均可能生成生物膜，加剧水产品腐败和细菌污染问题，且生物膜形成能力与细菌本身多方面如群体感应系统、信号分子、编码的特殊蛋白和基因调控系统等密切相关。目前，国内外生物膜研究更偏向于致病菌，而对于腐败菌相关研究仍较少。同时，在实际环境中，并非单一细菌独立生成生物膜，而是多种细菌在水产品或加工环节中相互影响共同作用，后期应加强食源性混合菌种生物被膜的形成与种间相互作用研究。目前，已有商品化的噬菌体被应用到食品加工环节中有效抑制致病菌的生长繁殖，且针对细菌生物膜的防控研究具有一定的研究基础。应用噬菌体及其裂解酶对水产品表面细菌生物膜的抑制应用仍然较少，并缺乏针对水产品或加工环境接触面上的混合菌种生物膜的抑制作用研究。未来有待在阐明噬菌体及其裂解酶应用安全性的基础上，建立规范的生产使用技术，逐步推广其在水产品细菌防控中的应用。