杂交鲌“先锋1号”染色体组型分析和DNA含量测定

王 鑫，马 浩，祝东梅，孙 宁，李 清，王贵英，陈 见，孙艳红，李 佩

( 1.武汉市农业科学院水产研究所，武汉先锋水产科技有限公司，湖北，武汉 430207; 2.华中农业大学 水产学院，湖北，武汉 430070 )

远缘杂交是指2个物种的亲缘关系在种间或种间以上的杂交方式，是使杂交后代基因型和表现型发生改变的有效方法。鱼类远缘杂交在脊椎动物中最为常见，因鱼类染色体具有很好的可塑性，不同科、亚科、属或种的鱼类杂交后，双亲的染色体能自由配对组合，相容性和协调性好，能综合2个或多个品种的优势遗传物质从而产生杂种优势，因此，利用远缘杂交可获得在生长速度、抗病力、抗逆性和品质等生产性状方面比亲本更优的后代[1-2]。截至2018年，通过我国水产原种和良种审定委员会审定的鱼类新品种中，杂交种42个，占总数的46.7%。杂交鲌“先锋1号”是翘嘴红鲌(Erythroculterilishaeformis)(♀)与黑尾近红鲌(Ancherythroculternigrocauda)(♂)通过属间杂交的子一代，于2013年通过审定，品种登记号为GS-02-001-2012[3]。杂交鲌“先锋1号”在食性、生长速度、饲料蛋白需求量和体型等方面融合了父母本的优势[4]。目前杂交鲌“先锋1号”已在全国范围内养殖[5]，经济效益显著，且2015—2017年连续3年被湖北省列为湖北省水产十大主推品种。

染色体组型(即核型)包含染色体的数目、大小以及形态特征，是物种的重要遗传属性[6-8]，因具有直观形象的分析优势，被广泛应用于鱼类的细胞遗传学分析[9-12]。DNA含量是物种重要的遗传特性之一，研究鱼类的DNA含量对鱼类分类、倍性及进化等方面具有重要的参考意义[13-15]。目前对杂交鲌“先锋1号”的研究涉及到营养、胚胎发育、毒理和遗传多样性等方面[3-4,16-17]，而对于染色体核型及DNA含量的研究尚未见报道，因此笔者对杂交鲌“先锋1号”的核型及DNA含量进行试验，探究其直观的遗传特性，为杂交鲌“先锋1号”的物种鉴定、亲缘关系研究及推广与应用等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用杂交鲌“先锋1号”取自湖北省武汉市农业科学院水产研究所国家级鲌鱼良种场，总计10尾，体长20～30 cm、体质量22～88 g的幼鱼，试验前将鱼暂养于华中农业大学水产学院室内水族箱中，用高锰酸钾提前消毒并曝气24 h，隔日换水，定期投喂，暂养7 d。试验取材为健康鱼的头肾以及血液。

1.2 杂交鲌“先锋1号”核型分析

染色体标本制备参照文献[18]采用体内注射植物血球凝集素(PHA)的方法，稍作修改。在杂交鲌“先锋1号”胸鳍基部注射PHA，剂量6 μg/g。待12～14 h后，在鱼体胸鳍基部注射8 μg/g秋水仙素，2 h后用一次性注射器尾静脉抽血放血，解剖鱼体，取出头肾放于盛有淡水鱼用生理盐水的培养皿中，用镊子去除血块，反复清洗，然后用100目细胞钢筛研磨过滤，用吸管将滤液移入15 mL离心管中，1000 r/min离心2次，每次6 min，每次离心后更换上清液并轻轻吹打几次。加入0.5% KCl溶液，室温低渗处理30 min，1000 r/min离心9 min后去掉上清液，加入新配制的卡诺氏固定液[V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1]固定15 min，1000 r/min离心9 min，并再重复固定2次；去上清液，加入少许卡诺氏固定液，用吸管轻轻吹打成悬液，喷片或滴片在预先冰冻过的载玻片上。

待空气干燥后，用10%的Giemsa染液[V(Gi-emsa)∶V(PBS)=1∶9混合]染色5～10 min，用清水轻轻冲洗干燥后于显微镜(Olympus，BX53)100倍油镜下观察拍照，选取100个清晰的染色体中期分裂相进行数目统计。用 Photoshop CS 6软件手工选取测量数目完整的最佳中期分裂相，按照文献[19]的分类标准进行配对分析，用Excel 2010软件对染色体的相对长度、臂比进行统计分析。

1.3 DNA含量测定

将试验鱼放入麻醉剂(MS-222，100 mg/L)中麻醉，用浸润过肝素钠的1 mL一次性注射器在杂交鲌“先锋1号”的尾静脉采血0.2～0.5 mL，去掉最开始的一滴血，然后加到含有1 mL PBS的EP管中，在避光条件下用DAPI染液按照V(血液)∶V(染液)=1∶1染色5～10 min，然后将公鸡血也按相同的方法进行染色，用流式细胞仪(德国Partec，CyFlow© Space)进行检测。本次试验选用公鸡血细胞DNA绝对含量(2.50 pg/2C)进行对照检测(2C：1个细胞核中的DNA含量)。杂交鲌“先锋1号”DNA含量按下式计算：

P1=(E2/E1)×P2

式中，P1表示杂交鲌“先锋1号”血细胞的DNA含量(pg/2C)，P2表示公鸡血细胞的DNA含量(pg/2C)，E1表示公鸡血细胞的消光值，E2表示杂交鲌“先锋1号”血细胞的消光值。

同时以同样的方法测定了母本翘嘴红鲌和父本黑尾近红鲌的DNA含量。

2 结果与分析

2.1 杂交鲌“先锋1号”染色体数目

选取杂交鲌“先锋1号” 100个清晰的中期分裂相进行数目统计，结果见表1。染色体数目在44及以下、46、47、49和50以上的很少，而数目为48条的染色体数目占总数的69%，所以杂交鲌“先锋1号”的染色体众数为48，可以确定杂交鲌“先锋1号”染色体的数目为2n=48。图1为杂交鲌“先锋1号”染色体中期分裂相。

表1 杂交鲌“先锋1号”染色体数目统计Tab.1 Chromosome counts of culter hybrid F1[E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”

图1 杂交鲌“先锋1号”染色体中期分裂相Fig.1 Metaphase chromosomes of culter hybrid F1 [E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”

2.2 杂交鲌“先锋1号”染色体核型

统计24对染色体的相对长度和臂比，结果见表2。根据臂比值将染色体分为3组，其中中部着丝粒染色体(m)为14对，近中着丝粒染色体(sm)为9对，近端着丝粒染色体(st)为1对，无顶端着丝粒染色体(t)，未发现随体和次缢痕，也未发现与性别有关的异型性染色体。所以，根据染色体的相对长度、臂比等可以确定杂交鲌“先锋1号”的染色体核型为28m+18sm+2st。染色体臂数(NF)为94。杂交鲌“先锋1号”染色体核型见图2。

2.3 杂交鲌“先锋1号”的DNA含量测定

对杂交鲌“先锋1号”、翘嘴红鲌和黑尾近红鲌血细胞的DNA含量进行测定，其DNA含量的流式细胞仪直方图见图3。用公鸡血细胞DNA做参照，计算出杂交鲌“先锋1号”的血细胞DNA绝对含量为(3.16±0.04) pg/2C，翘嘴红鲌的血细胞DNA绝对含量为(3.18±0.05) pg/2C，黑尾近红鲌的血细胞DNA绝对含量为(3.14±0.04) pg/2C。经统计分析三者的DNA含量没有显著性差异(P>0.05)。

图2 杂交鲌“先锋1号”染色体核型Fig.2 The karyotype of culter hybrid F1 [E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”

表2 杂交鲌“先锋1号”染色体相对长度、臂比及类型Tab.2 Relative length, arm ratio and types of chromosomes in culter hybrid F1 [E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”

图3 杂交鲌“先锋1号”及亲本的血细胞DNA直方图Fig.3 DNA histogram of erythrocytes of culter hybrid F1 “Xianfeng No. 1” and their parentsa.杂交鲌“先锋1号”； b.翘嘴红鲌； c.黑尾近红鲌； A.公鸡血的直方图； B.鱼的直方图.a.culter hybrid F1 [E. ilishaeformis (♀) × A. nigrocauda (♂)] “Xianfeng No. 1”; b.E. ilishaeformis; c.A. nigrocauda;a.the DNA histogram of erythrocytes in the rooster; B.the DNA histogram of erythrocytes in fish.

3 讨 论

3.1 杂交鲌“先锋1号”染色体核型分析

杂交鲌“先锋1号”为杂交子一代，目前对其母本翘嘴红鲌染色体核型的研究较多，王晓艳等[20]报道了洞庭湖翘嘴鲌的染色体数目2n=48，核型18m+10sm+18st+2t，NF=76；张伟明等[21]报道，翘嘴红鲌染色体数目2n=48，核型20m+24sm+4st，NF=92，余先觉等[22]报道，翘嘴鲌染色体数目2n=48，核型16m+26sm+6st，NF=90。三者研究翘嘴鲌染色体数目相同，而核型却不同，造成这种差异的原因可能是由于同一物种的分布地域不同，其染色体自身存在多态性[23]，不同地理位置的同一群体的核型会因地理环境不同而存在较大差异，从而使得染色体核型不同。还有可能是染色体制备方法不同，不同研究者选取分裂相不尽相同，同时还存在测量和配组误差，都会导致同种鱼的染色体核型不同[24]。杂交鲌“先锋1号”父本黑尾近红鲌染色体核型只有余先觉等[22]报道过，染色体数目为2n=48，核型为26m+18sm+4st，NF=92。本试验中，杂交鲌“先锋1号”染色体数目2n=48，核型28m+18sm+2st，NF=94，在染色体数目上与父母本一致，而在核型上存在差异，m数目比父母本多，st数目比父母本少，据此推测杂交鲌“先锋1号”染色体是翘嘴红鲌和黑尾近红鲌各一套染色体的组装与重新分配。相比来讲，杂交鲌“先锋1号”核型中m、sm和st数目与黑尾近红鲌更为接近，表明其与父本的遗传特性可能更相近，这与陈见等[4]通过AFLP研究得到的杂交鲌“先锋1号”与黑尾近红鲌遗传关系更近的结论一致。

关于鱼类杂交子一代与亲本染色体的核型分析，国内外有许多研究报道，笔者对部分结果进行汇总分析(表3)，得出以下规律：第一，杂交子一代与亲本的染色体数目相同，常见于父母本之间的染色体数目相同，其染色体是父母本各一套染色体的组合，本次试验所得的结论符合此规律；第二，杂交子一代与亲本的染色体数目不同，常见于父母本之间的染色体数目不同，其染色体是父母本染色体数目之和的均值，也见于杂交子一代染色体数目仅与母本相同是因雌核发育的结果[19]；第三，在核型特征方面，杂交子一代有的与母本完全相同[25-27]，多数是父母本的染色体发生了重组，核型介于父母本之间[28-30]。也能发现亲本的核型越相似，杂交也会越成功，可见在遗传进化过程中染色体具有一定的保守性。

表3 已报道的杂交F1与其亲本的核型特征比较Tab.3 Comparison of karyotypes of the hybrid F1 and their parents reported now

3.2 杂交鲌“先锋1号”的DNA含量

测定生物的DNA含量是研究其基因组的一个手段，它可以反映出该生物基因组大小和倍性[39]。检测生物DNA含量可采用显微分光光度计法和流式细胞仪法，其中流式细胞仪法具有快速、准确、简便等特点而被广泛应用[30,40]。公鸡血是流式细胞仪法中最常用的参考标准，因此本试验采用公鸡血作为标准，使用流式细胞仪测定杂交鲌“先锋1号”及其亲本的DNA含量，结果表明，杂交鲌“先锋1号”的DNA含量介于亲本之间，与父母本的DNA含量没有显著性差异(P>0.05)，均为二倍体。在之前其他杂交鱼类的报道中，杂交F1的DNA含量基本都介于亲本之间，如团头鲂(♀)×翘嘴鲌(♂)[41]、草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)[42]、小黄鱼(♀)×大黄鱼(♂)[43]等，本试验结果与上述报道一致，这也体现出杂交F1保持了亲本相对的遗传稳定性。杂交鲌“先锋1号”DNA含量的测定为其与亲本物种鉴定及亲缘关系研究提供了参考。

4 结 论

国审品种杂交鲌“先锋1号”(翘嘴红鲌♀×黑尾近红鲌♂)的染色体数目为2n=48，核型公式为28m+18sm+2st，染色体臂数NF=94，其染色体数目与父母本相同，核型与父本黑尾近红鲌更为接近；杂交鲌“先锋1号”DNA含量为(3.16±0.04) pg/2C，与父母本的DNA含量无显著性差异。本试验结果将对杂交鲌“先锋1号”的基础研究及推广应用提供积极参考作用。