盐度驯化下许氏平鲉血清生化指标及渗透压的变化

成智丽，孙鹏飞，罗 珺,2，沈双烨，张赛赛，王 伟

( 1.大连海洋大学,辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室,辽宁 大连 116023； 2.大连圣亚旅游控股股份有限公司，辽宁 大连 116023； 3.大连市现代农业生产发展服务中心， 辽宁 大连 116023 )

许氏平鲉(Sebastesschlegelii)，属脊索动物门、辐鳍鱼纲、鲉形目、平鲉属[1]。目前，对许氏平鲉的研究主要集中在基础生物学[2-4]，消化及组织化学[5]，环境胁迫[6-7]和营养需求[8-9]等方面。我国在20世纪80年代后期人工育苗获得成功[10]，目前许氏平鲉已经成为我国及日本等周边国家一种重要的海水网箱养殖种类，具有较高的经济价值。

盐度对鱼体的影响主要在于生理生化反应、免疫、生长发育、摄食和繁殖等，不同盐度条件下鱼类会表现相互不同的适应状态[11-15]。目前盐度胁迫相关研究主要集中在大鳞大马哈鱼(Oncorhynchustshawytscha)[16]、大西洋鲑(Salmosalar)[17]、尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[18]、眼斑拟石首鱼(Sciaenopsocellatus)[11]、墨绿凹鼻鲀(Chelonodonnigroviridis)[19]等鱼类中，而关于许氏平鲉的相关研究较少。研究发现，广盐性鱼类通过调节细胞膜的通透性[19]、营养代谢途径[20]和机体离子浓度[21]等多种方式来调节渗透压，以适应水体中盐度的变化。当环境中盐度发生变化时，鱼类的鳃、肠道和肾脏等器官的渗透压转移因子[22-23]、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽S-转移酶[24]、Na+/K+-ATP酶离子转移酶[25-26]等物质首先参与调节渗透压和电解质浓度，使机体形成新的渗透压平衡以适应环境中盐度变化。笔者主要对许氏平鲉在盐度驯化后血清的生化指标及渗透压变化进行研究，进而为许氏平鲉的养殖生产和海水鱼淡化养殖提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用鱼捕捞自大连旅顺及黑石礁海域，共140尾，均为健康个体。其体质量(94.32±6.41) g，体长(19.13±1.32) cm。

将采集后的试验鱼带水充氧运回实验室后，先放在室内(24 ℃左右)暂养7 d。暂养期间，盐度32，每日8:00投喂1次，饲料日投喂量约为鱼体质量的3%，日换水率不少于50%。

1.2 主要仪器和设备

离心机(CT15RE，Hitachi Koki Co.,Ltd.)，电子天平[PL203，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司]，盐度计(WZ-211，北京万成北增精密仪器有限公司)，渗透压仪(OSMOMAT030)，全自动生化分析仪(BS-400，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。

1.3 试验设计

临床毒理病理变化将生物体反应分为急性期、慢性期和恢复期。因此，根据感染、炎症、组织损伤等应激原作用于机体后的时间长短，将驯化试验设计分为在数小时至数日内(急性)和数十日以上(慢性)两个阶段。

1.3.1 急性盐度驯化试验

许氏平鲉急性盐度驯化试验设置盐度为30、25、20、15、10、5、4、3、2、0共10个盐度梯度组，试验组水体盐度分别加入生化海水晶进行调节，并使用盐度计进行测定，每个试验组另设2个平行，每个平行放鱼4尾。此外设置3组阴性海水对照组(盐度为32)，用以确定试验用鱼健康，对照组不计入死亡率统计。试验开始将暂养于盐度为32的海水中的试验用鱼分别放入各试验组中，观察并记录各组在3、6、9、12、24、48、72、96 h许氏平鲉的死亡尾数。急性盐度驯化试验阶段不进行投喂。

根据Karber氏法的原理，对3、6、9、12、24、48、72、96 h半致死盐度(LD50)及其安全盐度(SC)[27]用Excel进行运算。其运算公式为：

lg LD50=∑1/2(Xi+Xi+1)(Pi+1-Pi)

CI=lg-1(lg LD50±1.96×Sm)

SC=(48 h LD50×0.3)/(24 h LD50/48 h LD50)2

式中，Xi为对数剂量，Pi为死亡率，CI为半致死盐度的95%可信限，Sm为标准误，d为对数差，n为试验动物数。

1.3.2 慢性盐度驯化试验

将暂养后的试验鱼随机分成4组，1组为海水对照组(盐度为32)，另3组为试验平行组，每组放鱼15尾。根据急性试验驯化所得的半致死盐度，慢性盐度驯化的盐度设置9个梯度，分别为32、30、27、24、21、18、15、12、9，每次按照盐度梯度由高到低，每隔7 d、每试验组每槽降低1盐度后，在第1天的14:00取样，并进行血清相关生化指标的测定。

1.3.3 试验管理

试验用养殖水槽容积为200 L(进行驯化试验时用阻拦网固定在每个水槽上方，用以防止试验鱼跳出死亡)。试验期间保持每日换水，低盐度海水由砂滤海水(盐度32)和曝气后的自来水(盐度0)兑制而成。换水前24 h将水调至试验所需盐度并充气。

慢性盐度驯化试验阶段每天8:00进行配合饲料投喂，投喂后1.5 h将残饵及粪便吸出。试验期间水温控制在约24 ℃，24 h连续充气，每隔2 h进行盐度监测。

1.4 血清制备方法和渗透压测定

用1 mL注射器自尾静脉取血，将抽出的血液分为两份静置5 h，取血清即待血液凝固后3200 r/min离心10 min，分离上清液。采取冰点下降法，50 μL血清用冰点渗透压计对试验鱼血清渗透压进行测定(单位mOsm/kg)。

将剩余制得血清当天送至大连市体检中心，采用迈瑞BS-400全自动生化分析仪测定谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、尿素、总蛋白、血糖、白蛋白、白球比等指标。

1.5 数据处理与分析

用Excel计算许氏平鲉的半致死盐度及安全盐度，渗透压结果用SPSS 19.0进行显著性分析，以α=0.05作为显著差异水平。

所有数据均以3个平行试验组数据的平均值±标准差表示，各组试验结果采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，用Duncan多重比较进行组间差异比较，以P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 许氏平鲉在急性盐度驯化中的半致死盐度

许氏平鲉在4～30的盐度内生存良好，当盐度降至3(包括3)以下时才出现死亡，在盐度为0的条件下，6 h内试验鱼全部死亡。当盐度为2和3时试验鱼在48 h内全部死亡。96 h内不同时间的半致死盐度见表1，48 h与72 h的半致死盐度一致，根据24 h和48 h的半致死盐度可以计算出许氏平鲉的安全盐度，为0.04。

2.2 盐度驯化许氏平鲉体内渗透压变化

随着盐度不断的降低，许氏平鲉体内渗透压出现了2个峰值，分别是盐度9和盐度18的条件下，渗透压分别为(366±48.5) mOsm/kg、(366±48.38) mOsm/kg，峰值也极为接近，低谷出现在盐度3、盐度12和盐度21的条件下，但是盐度3以下渗透压变化剧烈出现最低值，渗透压为(173.3±4.51) mOsm/kg，明显下降。在盐度24～32条件下，试验鱼体内渗透压比较平稳，无明显差异(图1)。

表1 96 h内不同时间的半致死盐度Tab.1 Median-lethal salinity at different times within 96 h

图1 不同盐度驯化下许氏平鲉渗透压的变化规律Fig.1 Variations in osmotic pressure in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii under different salinity acclimation

2.3 慢性盐度驯化对许氏平鲉血清生化指标的影响

2.3.1 谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性的变化规律

谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性的试验结果见图2。许氏平鲉在盐度降至24时谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶均呈现高值，其活性分别为(68.67±3.51)、(18.67±3.06) U/L和(726±27) U/L。谷草转氨酶在盐度降至21以下时，活性一直较低，海水对照组(盐度32)谷草转氨酶活性与盐度30、24组差异不显著(P>0.05)，但与其余盐度组差异显著(P<0.05)。随着盐度的改变，谷丙转氨酶活性呈上下波动的现象，盐度27、24、21、15组与海水对照组差异显著(P<0.05)。乳酸脱氢酶活性随着盐度的降低呈先降后升再降再升的变化趋势。盐度27、24、15、9组的乳酸脱氢酶活性和海水对照组差异显著(P<0.05)。

图2 盐度变化对许氏平鲉血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、 乳酸脱氢酶活性的影响Fig.2 Effects of salinity on activities of glutamic-oxaloacetic transminase (GOT), glutamic-pyruvic transaminase (GPT) and lactic acid dehydrogenase in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.2 尿素的变化规律

尿素浓度随着盐度的不断降低而呈现下降趋势，各个盐度组和海水对照组差异显著(P<0.05)(图3)。在盐度为9时达到最低值，为(0.68±0.06) mmol/L。

图3 盐度变化对许氏平鲉血清尿素浓度的影响Fig.3 Effects of salinity change on serum urea (UREA) concentrations in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.3 总蛋白和白蛋白的变化规律

总蛋白和白蛋白质量浓度随着盐度的降低，上下波动的幅度不大(图4)。总蛋白质量浓度在盐度为21时达到最低值，与海水对照组差异显著(P<0.05)。而白蛋白质量浓度在盐度为24时达到最低值，并与海水对照组有显著差异(P<0.05)。

图4 盐度变化对许氏平鲉血清总蛋白和白蛋白质量浓度的影响Fig.4 Effects of salinity on serum total protein and albumin concentrations in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.4 血糖的变化规律

许氏平鲉的血糖浓度在盐度降到24时呈现峰值(图5)，为(6.04±0.16) mmol/L，与其余各盐度组差异显著(P<0.05)。血糖浓度在盐度为21时出现最低值，和海水对照组差异不显著(P>0.05)，但是总体上随盐度降低而呈升高的趋势。

图5 盐度变化对许氏平鲉血液中血糖浓度的影响Fig.5 Effects of salinity change on the level of plasma glucose in the blood of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.5 白球比的变化规律

各盐度组的白球比随着盐度的降低上下波动不大，各组和对照组比较均无显著差异(P>0.05)(图6)。

图6 盐度变化对许氏平鲉血液中白球比的影响Fig.6 Effects of salinity change on the ratio of A/G in the blood of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

3 讨 论

3.1 比较急性盐度驯化和慢性盐度驯化

急性盐度驯化条件下，许氏平鲉在盐度4、5、10、15、20、25、30时96 h内均可以存活；慢性盐度驯化条件下，当盐度继续降低到3时，出现多种不适应状态。当盐度超出许氏平鲉调节范围时就会死亡。对咸海卡拉白鱼(Chalcalburnuschalcoidesaralensis)[28]的试验结果表明，咸海卡拉白鱼在盐度为9.38的水中60 d存活率为87.5%，盐度低于11.32的试验组30 d存活率为100%，60 d为75%，而在盐度为13.62的水体中，24 h内鱼体全部死亡，盐度高于15，12 h死亡率高达100%。咸海卡拉白鱼属鲤科，为淡水鱼，对于盐度变化非常敏感，自身渗透压调节机制无法满足其在高盐度水体中正常生活。沈双烨等[29]对鲤鱼(Cyprinuscarpio)盐度驯化的试验结果显示，盐度0～12时，鱼体生存良好，3 h内盐度到14时开始出现死亡，说明鲤鱼作为淡水鱼对高盐度水体敏感，而对低盐度水体耐受。胡发文等[30]对大泷六线鱼(Hexagrammosotakii)的研究表明，大泷六线鱼幼鱼在低盐度水体中出现明显的不适反应并死亡，在盐度为30时，存活率最高。王晓雯等[31]对杂交鲟(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)幼鱼的研究亦显示，盐度变化会引起鱼体反应。以上研究结果与本试验结果均说明，水体的盐度变化对鱼体的存活与生长影响显著。

3.2 许氏平鲉盐度驯化渗透压的变化

鱼类对盐度的适应主要分为被动的环境适应和主动的调节恢复两个阶段。在盐度逐渐降低的条件下，试验鱼体内渗透压先应激降低适应环境，但盐度继续降至18时，鱼体内渗透压升高，进行主动调节适应以维持内环境稳定。本试验虽未测定Na+/K+-ATP酶离子转移酶活性，但是得到了与对日本鳗鲡(Anguillajaponica)[32]以及对花鲈(Lateolabraxmaculatus)[33]渗透压变化相一致的数据趋势，这表明许氏平鲉在盐度变化条件下体内渗透压调节机制可能与上述研究对象相似。也显示出许氏平鲉具有一定的渗透压调节能力。

3.3 许氏平鲉盐度驯化各生化指标的变化

鱼类血清生化指标可以作为生物监测和环境毒理学的参考标志物。指标观测值的变化反映了鱼类对环境改变的适应程度。因此，评价鱼类健康和环境监测方面鱼类血液生化指标具有潜在的应用价值[34]。

一般在水生动物体内正常生理状态下谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性处于较低水平，当机体受胁迫时从肝细胞释放到血液中，常作为环境胁迫特别是毒性试验的检测指标[35]，可用于指示水生生物健康及胁迫程度[36]。本试验中，盐度21时许氏平鲉血清中谷丙转氨酶含量最低，说明这个盐度下鱼体内肝细胞的细胞通透性不强，细胞损伤不大，而在盐度15、24、30、32下生长的许氏平鲉，鱼体内细胞损伤强度明显处于最高峰。这些说明慢性盐度驯化过程对许氏平鲉的胁迫比较大，这可能是一种适应性生理性的变化；另外，据王晓杰等[6]研究结果，不排除内脏组织已经出现病变的可能。

乳酸脱氢酶是糖酵解酶，可催化乳酸脱氢生成丙酮酸。而乳酸是作为鱼类对外界胁迫的应激反应的间接指标。有研究指出，环境胁迫引起鱼类的初级反应为内分泌变化，如儿茶酚胺和皮质类固醇的升高，随之刺激血液中葡萄糖和乳酸的增加[37]。本试验虽未检测血清中乳酸的含量，但可以通过乳酸脱氢酶的变化规律来推测血清中乳酸的变化规律。本试验中，许氏平鲉的乳酸脱氢酶随着盐度的变化呈现先降后升再降的变化趋势，因此，可以推测出许氏平鲉血清中乳酸亦是以这个趋势显著发生变化的(P<0.05)，在盐度24的时候出现高值，可能说明，在盐度24～32内许氏平鲉乳酸随着盐度的持续升高而降低。

鱼类属于排氨动物，尿素是蛋白质代谢的终产物。冯广朋等[36]通过研究温度对中华鲟代谢酶等的影响中指出尿素的指标常被用来评估肾脏和鳃的功能。有研究显示，在饥饿状态下的不同鱼类尿素的排放规律不一致，呈现下降或上升的趋势[38-39]。在本试验中，随盐度的降低许氏平鲉尿素浓度呈下降趋势。本试验结果与江丽华等[40]对褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)的研究结果相似，由于鱼的种类不同，尿素的排放规律也不同。

研究显示，血糖和总蛋白水平受蛋白质分解代谢和肝糖原分解的影响[41-42]，当生物体处于慢性盐度驯化时，糖类首先迅速被用于供能，碳水化合物以单糖形式进入血液，从而使血糖浓度升高[40]。除了受胰岛素和肾上腺素控制外，血糖还受机体的多种方式调节，因而在机体中血糖总量处于动态平衡中，但也极易受其他胁迫因子的影响[43-45]，比如水环境、饥饿等。李懋等[46]认为，鱼在受伤或饥饿状态时血糖水平会降低。本试验中，许氏平鲉在慢性盐度胁迫下血糖水平与盐度呈负相关。因此，可能是由于盐度变化后组织对葡萄糖的利用率降低，导致血糖浓度升高，也可能是渗透机制调节中的高能量需求而使组织糖原异生作用增强，导致血糖浓度升高[47]；在盐度9～21内，可能推测许氏平鲉在这个盐度环境下，运动强度升高，导致血液中血糖浓度降低；在高盐度环境如盐度27～32下血糖浓度的降低可能是由于盐度的突变对许氏平鲉刺激性加强，而鱼类机体主要是通过自身血糖代谢和无氧代谢所产生的糖质来提供所需能量[48]，故而大量消耗体内葡萄糖。

另有研究指出，白球比与血浆胶体渗透压相关，且白球比与血浆胶体渗透压成正相关[49]。在本试验中，许氏平鲉的白球比均呈现上下略微波动的现象。说明很长一段时间内血清的白球比在受盐度胁迫后都是相对稳定的。