豨莶草提取物对冠状动脉结扎大鼠心肌AKT及ERK1/2表达的影响*

2021-05-24宝玲玲李娜曹莉樊帆王慧

天津中医药 2021年5期

宝玲玲，李娜，曹莉，樊帆，王慧

（1.内蒙古自治区国际蒙医医院病理科，呼和浩特 010065；2.内蒙古医科大学附属医院急诊科，呼和浩特 010059）

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态[1]。正常情况下心脏活动所需要的能量靠有氧代谢提供，当某种原因导致心肌血液供需失衡，就会造成心肌缺血，冠心病是引起心肌缺血最主要的病因[2]。豨莶草能抗血栓形成，改善微循环，有研究表明豨莶草提取物对压力超负荷型心肌重构具有一定的保护作用，豨莶草提取液可通过降低实验性急性心肌缺血模型大鼠血清丙二醛（MDA）含量而产生对急性心肌缺血的保护作用[3]。文章对该药提取物进行了有关心肌缺血损伤药效学试验。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠90只，雄性，体质量180～220 g，由内蒙古大学实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（蒙）2016-0002。

1.2 受试药物及试剂豨莶草提取物提取方法，采用8倍量70%乙醇，浸润豨莶草2 h，加热回流提取3 次（第 1 次 2.5 h，第 2 次 1 h，第 3次 1 h），回收乙醇，减压干燥即得。人拟日用生药量为30 g，豨莶草由内蒙古自治区国际蒙医医院提供。枸橼酸钠，国药集团化学试剂有限公司。枸橼酸，国药集团化学试剂有限公司。无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司。氯化钾，磷酸氢二钾，国药集团化学试剂有限公司。水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司。二甲苯，国药集团化学试剂有限公司。磷酸氢二钾，国药集团化学试剂有限公司。磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司。氯化钠，国药集团化学试剂有限公司。TMS-P超敏试剂盒，福建迈新生物技术开发有限公司。DAB显色试剂盒，福建迈新生物技术开发有限公司。磷酸化蛋白激酶（AKT）北京博奥森生物技术有限公司。丝裂原活化蛋白激酶1/2（ERK1/2）单克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 仪器 BX53型光电显微镜：奥林巴斯中国有限公司生产。JKDP2型电热恒温培养箱：厦门医疗电子仪器厂生产。TP1020型自动脱水机，德国徕卡生产。YG-280KX型摊片机，湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司生产。YG-280KX型烤片机，湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司生产。Leica切片机，德国徕卡生产。

1.4 动物模型的建立及分组给药 90只SPF级SD大鼠，雄性，按体质量随机分为假手术组、模型对照组、豨莶草提取物低剂量组（2.70 g生药/kg）、豨莶草提取物中剂量组（5.40 g生药/kg）、豨莶草提取物高剂量组（10.80 g生药/kg）、硝酸异山梨酯组（3 mg/kg），每组15只。灌胃给药，体积为10 mL/kg，假手术组和模型对照组灌胃等体积蒸馏水。腹腔注射5%水合氯醛（6 mL/kg）进行麻醉，气管插管后连接呼吸机[4]。沿着胸骨左缘3～4肋骨间隙开胸，暴露心脏，用无创缝合线在左心耳根部下方2 mm处结扎，断其血流，心肌逐渐泛白可证明手术成功，将心脏送回胸腔，闭合胸腔[5]。假手术组只穿线不结扎。恢复胸腔负压，术后缝合，每层均撒青霉素钠粉，术后第2天每只大鼠腹腔注射青霉素4万U/d，连续3 d以防止术后感染[6]。连续给药4周。末次给药1 h后，腹腔注射5%水合氯醛（6 mL/kg）进行麻醉，腹主动脉采血检测谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸磷酸激酶（CK-MB），处死动物，取心脏福尔马林固定，用于苏木精-伊红染色（HE）及免疫组化染色。

1.5 缺血区心肌组织HE染色取缺血区心肌组织于福尔马林中固定24 h后，将心肌组织从固定液中取出，脱水后石蜡包埋。石蜡切片透明剂（Ⅰ）浸泡 10 min，透明剂（Ⅱ）浸泡 10 min，无水乙醇（Ⅰ）浸泡3 min，无水乙醇（Ⅱ）浸泡3 min，95%乙醇浸泡3 min，85%乙醇浸泡 3 min，70%乙醇浸泡 3 min，蒸馏水浸泡5 min。HE染色5 min，流水冲洗10 s，1%盐酸乙醇浸泡 5s，蒸馏水洗 1min，0.5%HE 染色 3min，蒸馏水洗5 s，80%乙醇浸泡10 s，95%乙醇浸泡30s，无水乙醇浸泡5min，二甲苯浸泡10min，中性树胶封片后在光学显微镜下进行观察。心脏病理分级标准：0级，无病变；1级，局灶性的间质反应；2级，多处局灶性损害，肌纤维肿胀断裂；3级，退行性损害伴玻璃样坏死，部分心肌细胞溶解消失；4级，左心室片状透壁坏死，肉芽组织增生，呈单核细胞浸润[7]。

1.6 缺血区心肌细胞AKT及ERK1/2的表达的检测大鼠缺血区心肌组织石蜡切片，60℃烘烤4 h，石蜡切片透明剂（Ⅰ）浸泡10 min，透明剂（Ⅱ）浸泡10 min，无水乙醇（Ⅰ）浸泡3 min，无水乙醇（Ⅱ）浸泡3 min，95%乙醇浸泡3 min，85%乙醇浸泡3 min，70%乙醇浸泡3 min，蒸馏水浸泡3 min。3% H2O2去离子水孵育5 min。磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次。于枸橼酸钠缓冲溶液中（pH7.0）高压修复5 min。血清封闭 15 min，PBS 稀释的一抗（AKT 1∶450，ERK1/2 1∶400），于37℃孵育4 h。PBS冲洗3次。滴加生物素标记的二抗，37℃孵育1 h，PBS缓冲液冲洗3次。滴加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，于37℃孵育30 min。缓冲液冲洗3次。滴加二氨基联苯胺（DAB）显色剂。清水冲洗。HE复染3 min，自来水冲洗3 s，1%盐酸乙醇5 s，清水冲洗1 min，中性树胶封片，免疫组化染色图片采用ImageJ软件进行灰度值分析。

1.7 统计学方法采用SPSS 24.0软件进行统计分析，实验数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若满足方差齐性采用LSD检验，若不满足方差齐性采用Dunnet’s C 检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 豨莶草提取物对冠脉结扎大鼠心肌酶的影响及病理形态的检测结果与空白对照组相比模型对照组血清LDH有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型对照组相比较，豨莶草提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组以及硝酸异山梨酯组血清 LDH 有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表1。与空白对照组相比，模型对照组血清CK差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比较，豨莶草提取物高剂量组以及硝酸异山梨酯组血清CK 差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表 2。与空白对照组相比，模型对照组血清CK-MB差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比较，豨莶草提取物中剂量组、高剂量组以及硝酸异山梨酯组血清CK-MB 差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表 3。与空白对照组相比，模型对照组血清AST差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型对照组相比较，豨莶草提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组以及硝酸异山梨酯组血清 AST 差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表4。与空白对照组正常心肌组织比较，模型对照组 HE 染色分级差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型对照组相比，豨莶草提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组和硝酸异山梨酯组心肌组织HE染色分级差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表 5、图 1。

图1 各组HE染色的结果（×200）Fig.1 HE staining results in each group（×200）

表1 豨莶草提取物对大鼠心肌缺血模型血清LDH 的影响（±s）Tab.1 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum LDH in rats with myocardial ischemia（±s）

组别空白对照组模型对照组豨莶草提取物低剂量组豨莶草提取物中剂量组豨莶草提取物高剂量组硝酸异山梨酯组动物数15 10 11 12 11 12剂量 LDH（U/L）- 964.32±347.61- 1 353.64±375.46 2.70 g 生药/kg 1 263.85±525.72 5.40 g 生药/kg 1 136.74±374.42 10.80 g 生药/kg 1 325.65±342.58 3 mg/kg 1 083.36±241.43

表2 豨莶草提取物大对鼠心肌缺血模型血清 CK 的影响（±s）Tab.2 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum CK in rats with myocardial ischemia（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组模型对照组豨莶草提取物低剂量组豨莶草提取物中剂量组豨莶草提取物高剂量组硝酸异山梨酯组动物数15 10 11 12 11 12剂量 CK（U/L）- 421.90±182.26- 739.10±133.56*2.70 g 生药/kg 593.30±195.38 5.40 g 生药/kg 534.90±128.94 10.80 g 生药/kg 474.10±155.69#3 mg/kg 466.30± 94.68#

表3 豨莶草提取物对大鼠心肌缺血模型血清CK-MB 的影响（±s）Tab.3 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum CK-MB in rats with myocardial ischemia（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组模型对照组豨莶草提取物低剂量组豨莶草提取物中剂量组豨莶草提取物高剂量组硝酸异山梨酯组动物数15 10 11 12 11 12剂量 CK-MB（ng/mL）- 721.81±212.58- 1 287.48±212.37*2.70 g 生药/kg 1 159.93±239.54 5.40 g 生药/kg 986.32±249.51#10.80 g 生药/kg 925.62±254.48#3 mg/kg 861.67±217.67#

表4 豨莶草提取物对大鼠心肌缺血模型血清AST 的影响（±s）Tab.4 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on serum AST in rats with myocardial ischemia（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组模型对照组豨莶草提取物低剂量组豨莶草提取物中剂量组豨莶草提取物高剂量组硝酸异山梨酯组动物数15 10 11 12 11 12剂量 AST（U/L）- 122.71±24.67- 166.37±23.79*2.70 g 生药/kg 148.53±27.75#5.40 g生药/kg 131.59±25.36#10.80 g 生药/kg 126.18±26.31#3 mg/kg 129.75±23.48#

表5 豨莶草提取物大鼠心肌缺血模型HE染色分级的影响（±s）Tab.5 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on HE staining grade of myocardial ischemia model in rats（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组模型对照组豨莶草提取物低剂量组豨莶草提取物中剂量组豨莶草提取物高剂量组硝酸异山梨酯组动物数15 10 11 12 11 12 3.56±0.47*2.70 g 生药/kg 3.12±0.53#5.40 g 生药/kg 2.74±0.46#10.80 g 生药/kg 2.51±0.52#3 mg/kg 2.67±0.46#剂量 HE分级-0±0-

2.2 对AKT及ERK1/2表达的影响与空白对照组相比，模型对照组大鼠心肌细胞AKT的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比，豨莶草提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组和硝酸异山梨酯组心肌细胞AKT的表达差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表6、图 2。与空白对照组相比，模型对照组大鼠心肌细胞ERK1/2表达差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比，豨莶草提取物中剂量组、高剂量组和硝酸异山梨酯组ERK1/2表达差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表 7、图 3。

图2 血清AKT表达的结果（×200）Fig.2 Results of serum AKT expression（×200）

图3 血清ERK1/2表达图片（×200）Fig.3 Results of serum ERK1/2 expression（×200）

表6 豨莶草提取物对大鼠心肌缺血模型AKT表达的影响（±s）Tab.6 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on AKT expression of myocardial ischemia model in rats（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组模型对照组豨莶草提取物低剂量组豨莶草提取物中剂量组豨莶草提取物高剂量组硝酸异山梨酯组动物数15 10 11 12 11 12剂量 AKT表达灰度值-71.36±16.52- 149.35±12.67*2.70 g生药/kg 121.52±13.51#5.40 g生药/kg 116.64±14.47#10.80 g 生药/kg 108.76±15.75#3 mg/kg 97.83±16.48#

表7 豨莶草提取物对大鼠心肌缺血模型ERK1/2表达的影响（±s）Tab.7 Effect of Siegesbeckia orientalis extract on ERK1/2 expression of myocardial ischemia model in rats（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组模型对照组豨莶草提取物低剂量组豨莶草提取物中剂量组豨莶草提取物高剂量组硝酸异山梨酯组动物数15 10 11 12 11 12剂量 ERK1/2表达灰度值- 116.68±17.43- 163.75±18.57*2.70 g 生药/kg 151.81±16.24 5.40 g 生药/kg 141.65±15.47#10.80 g 生药/kg 138.97±17.46#3 mg/kg 129.62±15.79#

3 讨论

血压降低及冠状动脉阻塞均可直接导致心脏供血减少引起心肌缺血。心瓣膜病、心肌本身病变及血黏度变化也会使心脏供血减少，其中最常见的原因是冠状动脉粥样硬化[8]。心肌酶是存在于心肌的多种酶的总称，包括AST、LDH、CK及其CK-MB等。AST存在于心肌、肾脏和肝脏等，以心肌含量最高，心肌、肝、肾病变时。组织损伤时AST才能在血清中测得。心肌梗死时，m-AST先于s-AST而升高[9]。乳酸脱氢酶存在于机体所有组织细胞的胞质内，是一种糖酵解酶。乳酸脱氢酶可催化乳酸脱氢生成丙酮酸。LDH同功酶的分布有明显的组织特异性，有心肌酶释放入血LDH1＞LDH2，利用此指标可以观察诊断心肌疾病[10]。肌酸激酶以心肌和骨骼肌含量多，肌酸激酶主要存在于细胞质和线粒体中，是与细胞内能量运转、肌肉收缩有直接关系的重要激酶[11]。肌酸激酶活性测定可以用于心肌病的诊断[12]。本研究结果表明，豨莶草提取物治疗组大鼠的心肌组织HE染色分级显著降低，心肌细胞肌纤维肿胀断裂及溶解消失症状减轻，心肌AST、CK及CK-MB均显著降低，LDH虽有所降低但未见显著性差异。

AKT为磷酸化蛋白激酶，它调节许多过程，包括代谢、增殖、细胞存活和血管生成。磷酸化蛋白激酶在成纤维细胞中是催化失活的[13]。AKT可被血小板衍生的生长因子激活，AKT以不依赖于转录的方式抑制细胞凋亡，然后激活细胞凋亡机制的组分磷酸化和灭活。AKT还通过磷酸化细胞凋亡信号调节激酶的磷酸化进而调节细胞存活[14]。磷酸化细胞凋亡信号调节激酶的磷酸化降低由氧化应激刺激的激酶活性，从而防止细胞凋亡。AKT可介导胰岛素样生长因子-I的抗细胞凋亡作用[15]。AKT信号通路被认为是预防心肌缺血损伤的重要级联信号通路，在氧化应激、炎症、钙超载、自噬、内质网应激和线粒体障碍等多种机制中处于核心位点，与心肌缺血损伤的严重程度密切相关。ERK1/2可以使脯氨酸相邻的丝氨酸/苏氨酸磷酸化[16]。ERK1/2的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键，细胞信号传递通路是由一个小GTP蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白组成的级联反应[17]。其活化的中心是使原癌基因Ras进行鸟苷酸交换变成其活化形式Ras2GTP。ERKl/2是Ras通路中重要的信号分子，位于Ras的下游，主要由生长因子受体介导激活。ERK1/2能减少血小板源性生长因子-2β的表达。ERKl/2通过磷酸化抗凋亡分子，同时激活转录因子，进而产生抗凋亡作用[18]。ERKl/2途径参与炎症因子、激素、生长因子、丝裂原受体活化信号的转导，细胞的增殖主要与这条通路有关，ERKl/2与心肌缺血损伤的修复存在密切关系。本研究结果表明，豨莶草提取物可以通过增加AKT及ERK1/2表达起到对心肌细胞的保护作用，减轻因心肌缺血引起的心肌细胞损伤。

综上所述，本实验通过对心肌缺血模型大鼠心肌酶的检测、缺血区心肌组织HE染色、免疫组化检测AKT及ERK1/2在缺血区心肌细胞的表达证明豨莶草提取物对心肌缺血引起的心肌细胞损伤具有的保护作用。