间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮骨质疏松效果分析

刘瑞霞，许文英（通讯作者）

（苏州市立医院本部 江苏 苏州 215000）

系统性红斑狼疮（SLE）是可累积全身各系统的自身免疫病，累及骨骼肌肉系统可导致骨量流失出现骨质疏松。由研究证实初发SLE 患者也可存在骨质疏松[1]，现阶段研究证实SLE 患者体内的炎症因子在其骨质疏松的发生发展中尤为重要[2]。有研究发现，SLE 患者体内TNF-α、IL-1、IL-6 等炎症因子水平异常[3-4]。近年来，越来越多的研究证实T 细胞产生的IL-17 在多种自身免疫性疾病中起重要作用[5-7]。在SLE 患者TNF-α可促进破骨前体细胞的增值，活化NF-KB 受体活化因子（RANK）促进破骨细胞生成，促进破骨细胞分泌RANK和成骨细胞分泌RANKL，二者结合可激活进一步NF-KB及其下游相关蛋白，这些蛋白分子促进破骨细胞的活化及分化成熟，从增加骨吸收[8-10]。目前研究已发现多条信号通路参与MSCs 成骨分化，如Wnt/β-catenin、BMP-Smads、Notch、Hedgehog、FGF，且相互调节，其中BMP/Smad 信号通路最早发现且最为重要[11]。间充质干细胞有多向分化潜能，具有免疫调控作用，通过临床行USMSCs 输注后评估骨代谢相关信号通路表达水平的变化。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年1 月—2016 年1 月住院SLE 并发骨质疏松患者8 例，均符合美国风湿病学会（ACR）1997 年SLE 分类标准，其中女性7 例，男性1 例，年龄30 ～50岁。入组患者分别与移植前、移植后1 月、3 月、6 月随访，使用PCR 方法检测患者外周血单个核细胞骨代谢基因表达水平。

1.2 方法

（1）分离外周血单个核细胞（PBMC），提取测定RNA。

（2）设计及合成引物：应用Primer Primier 5.0软件设计内参基因GAPDH 及目的基因的引物序列，上海生工生物工程技术公司合成。

（3）反转录及荧光定量：PCR 对RNA 进行反转录，同时对产物进行普通PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检验引物特异性并选取最佳退火温度。对各组标本的基因行荧光定量PCR。

1.3 统计学分析

应用SPSS 16.0 软件行统计学分析，以均数±标准差（±s）表示计量资料，各组数据符合正态性分布与方差齐性，采用单向方差分析进行多组之间的均数比较。P＜0.05 认为具有统计学差异。

2.结果

（1）对 比 移 植 后1 月、3 月SLE 患 者PBMC 的TNF-α、NF-κBp50 和NF-κBp65 mRNA 水平下降（P＜0.05），移植后6 月NF-κBp65 mRNA 水平仍较处于低水平，逐渐接近移植前水平且有统计学差异（P＜0.05）。详见表1。

表1 移植前后TNF/NFκB 信号通路mRNA 表达水平（± s）

表1 移植前后TNF/NFκB 信号通路mRNA 表达水平（± s）

TNFα NFκBp50 NFκBp65移植前 0.41±0.35 0.58±0.32 0.56±0.31移植后1 月 0.31±0.10 0.28±0.14 0.16±0.09移植后3 月 0.28±0.11 0.31±0.12 0.11±0.03移植后6 月 0.37±0.05 0.48±0.08 0.28±0.06 F 4.43 4.81 5.70 P 0.04 0.03 0.00

（2）移植前后BMP2、Smad1、Smad5 和Smad8 的mRNA 水平无统计学差异（P＜0.05），移植后6 个月逐渐接近移植前水平。详见表2。

表2 移植前后BMP/Smad 信号通路mRNA 表达水平（± s）

表2 移植前后BMP/Smad 信号通路mRNA 表达水平（± s）

BMP2 Smad1 Smad5 Smad8移植前 0.50±0.29 0.73±0.21 0.58±0.26 0.51±0.24移植后1 月 0.78±0.83 0.98±0.25 0.73±0.15 0.71±0.12移植后3 月 0.80±0.28 0.82±0.21 0.69±0.21 0.63±0.21移植后6 月 0.51±0.27 0.77±0.15 0.48±0.18 0.47±0.19 F 0.53 1.36 1.31 0.77 P 0.66 0.29 0.31 0.54

3.讨论

系统性红斑狼疮是以T、B 淋巴细胞等免疫功能异常为主要发病机制[12-13]，近年来随着SLE 生存率的增加，继发骨质疏松已成为影响患者生活质量的严重并发症[14-15]。

目前的研究认为TNF-α 水平异常诱导破骨细胞的分化和成熟是导致SLE 患者发生炎症介导骨质疏松的重要因素。本研究拟通过检测移植前后TNF-α/NF-κB 信号通路基因表达水平的变化评估脐带间充干细胞移植治疗SLE 骨质疏松有效性。在骨代谢中，偶联骨形成和骨吸收两个过程的重要信号通路是OPG/RANK/RANKL[17]，RANK/RANKL 在破骨细胞的生成调节中起重要作用，二者结合后入核启动NF-κB 的活化，进一步与NFAT-c1 结合启动破骨基因活化，诱导破骨细胞分化成熟[18]，而OPG与RANKL 竞争性结合科阻断上述过程，抑制下游信号转导，从而抑制破骨细胞分化成熟。

已有研究证实狼疮患者MSCs 成骨分化能力较正常人减弱[16]，近年来行MSCs 移植治疗难治性SLE 已有研究，本次试验我们经外周静脉移植，意在探讨MSCs治疗SLE 骨质疏松的可能机制。结果发现，在静脉输注MSCs 后的狼疮患者体内BMP/Smad 中基因表达水平变化虽无统计学差异，但整体水平有升高，且TNF-α/NF-κB 通路中各基因表达下降；据此有理由推测，UCMSCs 移植可能通过调节BMP/Smad 及TNF/NF-κB 信号通路治疗骨质疏松。

综上，本实验通过体内实验证实了UCMSCs 移植对骨代谢信号通路调节，一定程度上说明MSCs 移植治疗骨质疏松可能是通过抑制TNF-α，作用于MSCs BMP/Smad 信号通路。