洛伐他汀通过TAZ抑制人肺癌细胞增殖

胡 芃,郑 艺,赵于飞*,吴爱林,毛云飞,常 娜

(1 中国科学技术大学附属第一医院西区肿瘤放射治疗科,合肥 230001;2 安徽省肿瘤医院肿瘤放射治疗科;*通讯作者,E-mail:672827431@qq.com)

肺癌是发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤,然而多数化疗药物都具有不可忽略的毒副作用,因此寻求低毒高效的治疗药物迫在眉睫。老药新用,开发已上市药物新的适应证可以节省药物研发的成本和时间,也可以保证药物的低毒性,因此是开发低毒高效肿瘤治疗药物的可靠途径。他汀类药物是临床上广泛应用的一线降脂药物,通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMGCR)从而抑制下游胆固醇的合成。有研究显示他汀具有抗肿瘤活性[1-3],但对肺癌的作用及机制研究并不十分明确。Hippo信号通路是负责调节组织器官大小的信号通路,在进化上高度保守,其下游核心蛋白分子为YAP和TAZ两个辅助转录因子,YAP和TAZ可以入核,与TEAD转录因子结合形成复合物,促进靶基因的转录[4]。肿瘤的发生、发展是个十分复杂的过程,TAZ被证实参与了肺癌的发生发展,抑制YAP/TAZ能够抑制肺癌细胞的增殖和转移[5,6]。本研究以A549肺癌细胞为研究对象,考察洛伐他汀对A549肺癌细胞的增殖及凋亡的影响,并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 洛伐他汀购于美国MedChemExpress(HY-N0504)。RPMI-1640含双抗(100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素)培养基购于江苏凯基生物技术股份有限公司。RIPA裂解液(P0013C)、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于南京碧云天生物技术有限公司。总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、细胞凋亡试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司。ECL发光液购于上海天能科技有限公司。mTOR、AKT、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9、PARP、cleaved PARP、GAPDH抗体、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG购于武汉Proteintech。p-mTOR(Ser2448)、p-AKT(Ser473)、p70S6k、p-p70S6k(Ser371)、TAZ抗体购于美国CST。

1.1.2 细胞株 A549肺癌细胞株,购买于上海中科院细胞库。

1.1.3 仪器 血球计数仪,Corning公司(美国);酶标仪,BioTek公司(美国);台式高速冷冻离心机,Thermo公司(美国);微型离心机,Corning公司(美国);CytoFLEX流式细胞仪,Beckman Coulter公司(美国);电泳仪,Bio-Rad公司(美国);MicroChemi化学发光型凝胶成像系统,Azure公司(美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 A549肺癌细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,孵箱培养条件:37 ℃,5% CO2。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 A549肺癌细胞生长至适宜密度时,消化、离心,新鲜培养基重悬细胞后采用血球计数仪计数,将A549肺癌细胞均匀铺于96孔板中,每孔约为1 000个细胞,次日,细胞贴壁后给与不同浓度洛伐他汀(20,40,80 μmol/L),每组6个复孔,置于孵箱继续培养24 h(时间依赖性实验则加入40 μmol/L洛伐他汀,培养12,24,48 h),实验结束前4 h加入20 μl浓度为5 mg/ml的MTT,4 h后吸走96孔板中液体,加入120-180 μl DMSO,轻轻摇晃细胞培养板,使底部结晶充分溶解后490 nm波长处测定其光吸收值,根据光吸收值换算出抑制率。

1.2.3 细胞凋亡检测 A549肺癌细胞生长至适宜密度时,消化、离心,新鲜培养基重悬细胞后采用血球计数仪计数,取约2×106个细胞均匀铺于6孔板中,次日,加入不同浓度的洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)处理24 h,收集培养基上清并1 000 r/min离心5 min沉淀上清中的细胞,消化贴壁细胞后500 r/min离心5 min后PBS重悬并合并细胞,用PBS洗涤2次后加入500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,避光孵育5 min后,采用流式细胞仪进行检测。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达 A549肺癌细胞生长至适宜密度时,消化、离心,新鲜培养基重悬细胞后采用血球计数仪计数,每孔取约2×106个细胞接种于6孔板,包括对照组和3个不同浓度洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)处理组。洛伐他汀处理A549肺癌细胞24 h后,收集细胞样本,12 000g离心15 min后吸取上清置于另外干净1.5 ml离心管中,加入1/4体积5×loading buffer,混匀后100 ℃处理5-10 min,置于-20 ℃备用。考察TAZ在洛伐他汀抗A549细胞增殖中的作用时,预先转染TAZ质粒,48 h后加入40 μmol/L洛伐他汀继续处理24 h后收取蛋白样品,12 000g离心15 min后吸取上清置于另外干净1.5 ml离心管中,加入1/4体积5×loading buffer,混匀后100 ℃处理5-10 min,置于-20 ℃备用。制备SDS-PAGE凝胶,根据待检测蛋白的分子量和SDS-PAGE凝胶的最佳分子范围选择配制适合浓度的SDS-PAGE凝胶,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9采用12%的凝胶,mTOR、p-mTOR采用6%的凝胶,其余蛋白采用10%的凝胶。电泳采用两步法,Step 1电压80 V,40 min,Step 2电压120 V,60 min。湿转,根据待检测蛋白的分子量决定湿转时间,湿转电压维持在80 V以上;5%脱脂奶粉或5% BSA室温封闭1-2 h;一抗4 ℃孵育过夜;二抗室温孵育1 h;ECL发光液显影。

1.2.5 TAZ质粒和转染 TAZ过表达质粒为pBabe puro-mTAZ plasmid(Addgene plasmid#31791)。A549肺癌细胞生长至适宜密度时,消化、离心,新鲜培养基重悬细胞后采用血球计数仪计数,每孔取数量约2×106个细胞均匀铺于6孔板中,次日待细胞贴壁后,用Opti-MEM培养基预混1 μg对照质粒或TAZ过表达质粒和2 μl Lipo 3000后加入培养板中处理6-8 h,更换新鲜完全培养基继续培养48 h,收集细胞RNA和蛋白样品,采用qRT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平验证TAZ的表达。考察TAZ在洛伐他汀抗A549细胞增殖和诱导A549凋亡中的作用时,A549细胞预先转染TAZ过表达质粒,48 h后给于洛伐他汀进行干预。

1.2.6 qRT-PCR 总RNA提取:不同浓度的洛伐他汀(20,40,80 μmol/L)处理A549细胞24 h后,采用RNA提取试剂盒提取总的RNA。RT-PCR:采用逆转录试剂盒对总RNA进行逆转录处理,逆转录程序为42 ℃ 2 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存。qRT-PCR:95 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,68 ℃ 30 s进行40个循环;65-95 ℃制备溶解曲线。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 数据统计学分析

2 结果

2.1 洛伐他汀抑制A549肺癌细胞的增殖

20,40,80 μmol/L的洛伐他汀处理A549细胞24 h,MTT实验结果显示,随着洛伐他汀浓度的增加,A549肺癌细胞的存活率逐渐降低,40 μmol/L洛伐他汀组与20 μmol/L洛伐他汀组相比,A549肺癌细胞的存活率降低(P<0.05),80 μmol/L洛伐他汀组与40 μmol/L洛伐他汀组相比,A549肺癌细胞的存活率显著降低(P<0.05),80 μmol/L洛伐他汀组与20 μmol/L洛伐他汀组相比,A549肺癌细胞的存活率显著降低(P<0.05,见图1)。40 μmol/L洛伐他汀处理A549细胞12,24,48 h,随着作用时间的增加,A549细胞的存活率逐渐降低,24 h组与12 h组相比,A549肺癌细胞的存活率降低(P<0.05);48 h组与24 h组相比,A549肺癌细胞的存活率显著降低(P<0.05);48 h组与12 h组相比,A549肺癌细胞的存活率显著降低(P<0.05,见图1)。以上结果表明洛伐他汀可以浓度依赖性和时间依赖性地抑制A549肺癌细胞的增殖。

2.2 洛伐他汀抑制mTOR信号通路

mTOR信号通路负责调控细胞的增殖,采用Western blot考察洛伐他汀对mTOR信号通路的影响,Western blot结果显示,随着洛伐他汀浓度的增加,p-AKT,p-mTOR和p-p70S6k的表达逐渐降低(P<0.05,见图2)。该结果从分子水平证实了洛伐他汀对A549细胞的增殖抑制作用。

图1 洛伐他汀抑制A549细胞的增殖Figure 1 Lovastatin inhibits the proliferation of A549 cells

与0 μmol/L相比,* P <0.05图2 洛伐他汀抑制mTOR信号通路Figure 2 Lovastatin inhibits mTOR signaling pathway in A549 cells

2.3 洛伐他汀诱导A549肺癌细胞凋亡

细胞流式检测结果显示,随着洛伐他汀浓度的增加,A549细胞的凋亡率不断增加,0,20,40,80 μmol/L洛伐他汀处理后细胞凋亡率依次为(10.21±1.45)%,(22.29±4.31)%,(57.27±4.56)%,(62.58±3.43)%。与0 μmol/L组相比差异均具有统计学意义(P<0.05,见图3)。表明洛伐他汀可以诱导A549细胞发生凋亡。

图3 洛伐他汀诱导A549细胞发生凋亡Figure 3 Lovastatin induces apoptosis of A549 cells

2.4 洛伐他汀增加Caspase-3、Caspase-9、PARP的剪切

采用Western blot考察洛伐他汀对A549细胞凋亡标记物Caspase-9、Caspase-3和PARP剪切的影响,结果见图4。随着洛伐他汀浓度的增加,Caspase-9、Caspase-3和PARP剪切,即cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和cleaved PARP的表达增加(P<0.05)。该结果在分子水平证实了洛伐他汀诱导了A549细胞发生凋亡。

与0 μmol/L相比,* P <0.05图4 洛伐他汀促进Caspase-9、Caspase-3和PARP的剪切Figure 4 Lovastatin increased the cleavage of Caspase-9, Caspase-3 and PARP

2.5 洛伐他汀抑制A549肺癌细胞中TAZ的表达

Western blot结果发现,随着洛伐他汀浓度的增加,A549细胞中TAZ的表达逐渐减少(P<0.05),与0 μmol/L比较差异具有统计学意义(P<0.05,见图5),该结果表明洛伐他汀可以浓度依赖性地抑制A549细胞中TAZ的表达。

与0 μmol/L相比,* P <0.05图5 洛伐他汀抑制TAZ的表达Figure 5 Lovastatin inhibits TAZ expression in A549 cells

2.6 过表达TAZ减弱了洛伐他汀对A549细胞的增殖抑制作用

采用TAZ过表达质粒在A549细胞中过表达TAZ,结果TAZ在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著上调(P<0.05,见图6)。流式结果显示,过表达TAZ后,洛伐他汀对A549细胞的凋亡诱导作用明显减弱,单独洛伐他汀(40 μmol/L)组的凋亡率为(53.56±3.87)%,洛伐他汀(40 μmol/L)联合TAZ过表达组的凋亡率为(12.11±2.58)%,两组间差异具有统计学意义(P<0.05,见图7)。单独洛伐他汀(40 μmol/L)组的增殖抑制率为(51.43±4.82)%,洛伐他汀(40 μmol/L)联合TAZ过表达组的增殖抑制率为(9.35±3.55)%,洛伐他汀对A549细胞增殖抑制作用被明显逆转,差异具有统计学意义(P<0.05)。这些结果证明TAZ介导了洛伐他汀对A549细胞的凋亡诱导作用和增殖抑制作用。

与对照组比较,* P <0.05图6 TAZ过表达效率验证Figure 6 The efficiency of TAZ overexpression in A549 cells

图7 过表达TAZ逆转了洛伐他汀对A549细胞的凋亡诱导作用和增殖抑制作用Figure 7 TAZ overexpression reverses pro-apoptosis effect and anti-proliferative effect of lovastatin in A549 cells

3 讨论

他汀类药物是临床上最为常见的降胆固醇药物,其作用机制是通过竞争性抑制HMG-CoA还原酶的活性抑制甲羟戊酸的生成从而抑制下游胆固醇的合成。除了抑制胆固醇的合成之外,他汀类药物也具有抗肿瘤活性。本研究证实了洛伐他汀对肺癌A549细胞增殖的增殖作用和凋亡诱导作用,机制研究提示TAZ可能在洛伐他汀抗A549增殖中发挥重要作用。

研究结果表明,洛伐他汀诱导A549细胞发生凋亡,凋亡是细胞为维持内环境稳定,由基因控制的自主有序的死亡。通常表型为核浓缩、起皱、膜发泡以及DNA片段化,可由两种途径介导:一是TNF-α介导的死亡受体途径,又称外源性途径;二是线粒体途径,又称内源性途径[7]。Caspase-9的剪切增加是线粒体途径激活的标志之一,由此可以判定,洛伐他汀通过激活了线粒体途径诱导A549细胞凋亡。

他汀作为降胆固醇药物通过竞争性抑制HMG-CoA还原酶的活性抑制胆固醇合成的同时,也抑制了甲羟戊酸通路中其他中间代谢产物的合成,从而抑制异戊烯的合成,从而影响到蛋白的异戊烯化,抑制小G蛋白(small GTPase)的生理功能[8-10]。因此可推测,洛伐他汀可能通过抑制了某小G蛋白的生理活性从而影响到Hippo信号通路。TAZ是Hippo信号通路下游的核心成员,TAZ能够入核与TEAD家族转录因子结合形成转录因子复合物启动靶基因的转录[11,12]。TAZ可受上游Hippo信号通路中LATS1/2的磷酸化导致TAZ无法进入细胞核,使TAZ滞留在胞质中从而被降解[13]。有研究表明,TAZ能够调控细胞的增殖和凋亡[14,15],本研究发现洛伐他汀在抑制A549细胞增殖,诱导A549细胞发生凋亡的同时促进了TAZ的降解,由此可推断,洛伐他汀可能通过了下调TAZ诱导A549细胞发生凋亡,抑制其增殖。此外,他汀类药物作为临床上的常用药物,或许可以免去新药研发中的众多临床前实验步骤,这种“老药新用”的模式对于药物的开发具有积极的意义。

综上所述,本研究证实了洛伐他汀对A549肺癌细胞的增殖抑制作用,并对其机制做了初步探讨,为他汀类药物在临床上应用于肺癌的治疗提供了理论依据。