环扎法致大鼠脊髓损伤减压后TGF-β1表达与凋亡细胞的相关性

聂 虎,周乾坤,牛国旗,杨 民,徐祝军

(1 蚌埠医学院第二附属医院骨科,蚌埠 233000;2 皖南医学院弋矶山医院骨科;*通讯作者,E-mail:151810084@qq.com)

在美国，每年有超过17 000人遭受脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)，该疾病会导致损伤平面以下的突然运动、感觉及自主神经损伤，如何有效地促进SCI患者神经功能的恢复是当前基础及临床研究的热点[1]。既往观点认为，神经细胞不可再生，但是现有动物实验研究表明：在脊髓损伤早期对脊柱创伤行手术固定、脊髓减压等消除脊柱不稳定和椎管狭窄等因素，再在此基础上行适当的药物治疗、细胞移植、基因治疗、调节信号转导通路等有希望进一步促进自主神经功能的修复和神经细胞的再生[2-4]。

国外学者回顾性研究发现[5，6]，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在正常脊髓组织中几乎无明显表达，但在SCI后表达显著增高，因其具有免疫抑制和炎症抑制的作用，可抑制细胞凋亡进展，以减轻神经损伤的范围，可见脊髓损伤后该因子增加是神经元的一种自我保护反应。

本研究拟建立一种可形成持续静态压迫的大鼠脊髓损伤模型，通过不同时间点的脊髓减压治疗，来观察脊髓损伤的变化以及神经功能恢复进展情况，进一步研究TGF-β1的表达与凋亡细胞阳性细胞数的相关性，为SCI的修复研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

70只雄性SD(Sprague-Dauley)大鼠，平均13周龄，体质量169-261 g，平均体质量221.2 g。采用随机数字表法分组，分为假手术组10只，仅行胸椎(thoracic vertebra,T)10-11椎板切除，暴露脊髓，不进行环扎。手术组每组各15只，大鼠胸10-11椎板切除后，环扎脊髓，用环扎法使硬膜囊截面压缩至原截面积的70%，建立脊髓损伤模型，完成此次建模手术，术后按照时间设定进行去除环扎线的二次手术分为8 h减压组、24 h减压组、72 h减压组和不减压组。减压组分别环扎8，24，72 h后二次手术,去除环扎线减压；不减压组环扎后不进行二次手术减压。假手术组和不减压组只进行一次手术，在术后1，3，7，14，21 d统计神经功能评分并处死大鼠取出脊髓。8 h减压组、24 h减压组和72 h减压组进行二次手术后后1，3，7，14，21 d统计神经功能评分并处死大鼠，取出脊髓。假手术组各时间段取材2只大鼠，余各手术组各时间段取材3只大鼠，取损伤段脊髓标本切片进行HE染色，免疫组化(IHC)及TUNEL法检测，观察脊髓损伤后组织病理学变化，测定脊髓标本损伤段凋亡细胞的计数及TGF-β1的表达变化。

1.2 脊髓损伤模型制备

1.3 大鼠急性脊髓损伤后的护理

大鼠脊髓急性损伤后常导致截瘫，除假手术组外均表现为双下肢瘫痪，小便潴留，大便不能控制，大鼠护理期间注意室温调节，保持15-20 ℃，注意通风，勤换水、换垫料，保持鼠笼干燥。术后注意预防感染,术后每日定时人工按摩膀胱排尿，每日温肥皂水清洗双侧下肢及尾巴并保持干燥，防止肢体溃疡。大鼠取脊髓标本前行双盲法对每组大鼠进行神经功能评价，评价指标采用BBB评分(Basso,Beattie,Bresnahan locomotor rating scale)和斜板评分联合使用[8]。

1.4 标本制作及图像分析

对大鼠评估神经功能评分后，予乙醚吸入麻醉，经胸骨远端左缘快速开胸进入，小型静脉留置针准确插入左心室内，生理盐水灌注后迅速用4%甲醛充分灌注，30 min后暴露损伤脊髓上下段，取环扎处上下段共1.5 cm脊髓组织，置入4%甲醛中72 h,流水冲洗后进行梯度酒精脱水,浸蜡包埋，标签标记，冠状位切片，采用HE染色观察脊髓组织病理变化,免疫组化测定各时间点TGF-β1的表达,TUNEL法检测凋亡细胞水平。每张切片取光镜下3个视野400倍进行观察，采用JEDA 801D形态学图像分析系统进行图像统计采集分析。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 脊髓标本大体组织学变化

标本组织总体可见脊髓组织结构紊乱，部分可见脊髓空洞坏死及陈旧性出血表现。

2.2 HE染色观察

通过HE染色脊髓标本可发现假手术组脊髓组织、细胞形态保持完好(见图1A)；减压组可见损伤范围基本恒定，脊髓组织回缩变细、结构紊乱，出血、髓鞘水肿、断裂，部分可见脊髓空洞坏死(见图1B-D)。不减压组主要表现为空洞性坏死改变以及陈旧性出血表现(见图1E)。

图1 各组14 d脊髓取材标本HE染色镜下表现 (HE，×400)Figure 1 HE staining of spinal cord samples at day 14 in each group (HE，×400)

2.3 TGF-β1的表达

每张切片取400倍光镜下3个视野进行观察，以细胞浆和/或核棕黄色着色为阳性细胞。假手术组未见TGF-β1的阳性表达(见图2);8 h减压组、24 h减压组、72 h减压组及不减压组1 d取材标本TGF-β1开始表达，3 d时达到高峰，7 d时逐渐下降，至21 d仍有表达(见图2，表1)，且8 h减压组、24 h减压组和72 h减压组TGF-β1在21 d的表达普遍低于不减压组(见表1)。

图2 各组3 d取材标本免疫组化镜下表现 (IHC，×400)Figure 2 Immunohistochemical staining of the samples at day 3 d in each group (IHC，×400)

表1 各组不同时间点脊髓标本TGF-β1阳性细胞数比较

2.4 细胞凋亡的变化

每张切片取400倍光镜下3个视野进行观察，凋亡细胞呈棕褐色和棕黄色，胞核固缩颗粒深染不规则，于损伤区域及周围弥散性分布，假手术组基本无表达，各手术组3 d取材标本凋亡细胞数明显增多(见图3)。8 h减压组、24 h减压组、72 h减压组及不减压组1 d取材标本均有不同程度的表达，3 d达到高峰，后逐渐下降，21 d仍有表达(见表2)。72 h减压组各时间点凋亡细胞计数均显著高于8 h减压组、24 h减压组，而8 h减压组、24 h减压组、72 h减压组凋亡细胞计数又远低于不减压组(见表2)。

图3 各组3 d取材标本TUNEL染色 (TUNEL，×400)Figure 3 TUNEL staining of spinal cord tissues at day 3 in each group (TUNEL，×400)

表2 各组时间点切片凋亡细胞的计数统计

2.5 TGF-β1的表达与凋亡细胞计数的相关性分析

收集TGF-β1及凋亡细胞计数的统计数据，采用线性相关分析。各减压组TGF-β1及凋亡细胞计数相关分析显示：相关系数r=0.915-0.958，双侧Pearson检验P=0.010-0.029，在0.05水平(双侧)显著相关，有统计学意义(见图4)。可见，TGF-β1计数与凋亡细胞计数呈线性相关。

2.6 各组大鼠术后神经功能BBB评分及斜板评分

假手术组BBB及斜板评分大致接近正常，近似呈水平线。8 h减压组和24 h减压组BBB及斜板评分自术后1 d呈逐渐上升趋势，两者评分基本相似，无明显差异；72 h减压组各时间点BBB及斜板评分均较8 h减压组、24 h减压组组低。不减压组评分最低，且恢复趋势不明显，神经功能恢复差(见图5，6)。各组BBB及斜板评分组间行统计学分析， 8 h减压组与24 h减压组组间比较无统计学差异，其余各组两两比较均差异有统计学意义(P<0.05)。BBB及斜板评分8 h减压组、24 h减压组>72 h减压组>不减压组，可见减压后大鼠功能评分随着时间的推移，BBB及斜板评分呈逐渐上升的趋势，且评分优于不减压组大鼠功能评分。

图4 各组TGF-β1阳性细胞数及凋亡细胞计数的线性相关图Figure 4 Linear correlation of TGF-β1 positive cells with apoptotic cell counts in each group

与假手术组比较，aP <0.05；与8 h减压组比较，bP <0.05；与24 h减压组相比，cP <0.05；与72 h减压组相比，dP <0.05图5 各组不同时间点BBB评分Figure 5 BBB score at different time points in each group

与假手术组比较，aP <0.05；与8 h减压组比较，bP <0.05；与24 h减压组相比，cP <0.05；与72 h减压组相比，dP <0.05图6 各组不同时间点斜板评分Figure 6 Inclined board score at different time points in each group

3 讨论

获得理想的脊髓损伤动物模型是研究SCI损伤机制、探索神经修复过程、提高医治效果并将之应用于临床的首要前提。回顾以往文献，近20年来国内外先后报道了多种不同方法建立的脊髓损伤模型，造模的方法种类甚多，但各种造模方法各有优缺点。本研究根据实验的设计需要及临床SCI的损伤特点，对Richard等[9]报道的用带状物环绕犬圆锥并结扎，以制作硬膜囊受压动物模型的方法进行了改进，使之用于更易护理的啮齿类动物。环扎法较之以上所述方法具有以下优点：可一次性完成脊髓损伤及静态持续受压，术中无需特殊器械及仪器，方法简便易行，可重复操作性好。另外环扎法建立的脊髓静态持续压迫模型，与临床上脊柱骨折产生压迫致脊髓损伤的特点具有一定的相关性，符合实验结合临床的特点。

脊髓损伤后，不同减压时间点疗效是进行手术时机选择的重要依据；神经功能的评价是对模型术后功能恢复具有客观意义的评价标准。本实验采用两种评分相结合的方式，避免了单一评价方式的不足，在评价大鼠神经功能水平的同时也间接评价了大鼠后肢肌力的恢复水平，增加了实验评分的准确性和可靠性[10]。SCI要求积极早期减压[11,12]，但结合实际情况，如就诊、转诊时间、复合伤病情等，故8，24，72 h减压是黄金时间段，实验中细分这几个关键时间点，对于手术时机把握及获得最佳的远期疗效，具有重要意义。通过实验发现，假手术组大鼠术后BBB评分及斜板评分未见明显异常，总体评分基本接近于正常水平。8 h减压组、24 h减压组、72 h减压组大鼠评分情况较不减压组差异明显，8 h减压组、24 h减压组、72 h减压组大鼠不同时间减压后评分均逐渐提高，神经功能逐步好转，且8 h减压组、24 h减压组各时间点评分较72 h减压组差异明显，不减压组大鼠评分显示大鼠神经功能恢复缓慢，后肢肌力及运动能力未得到明显改善。

在本组实验中，对大鼠脊髓标本进行HE染色、免疫组化及TUNEL法检测来评价大鼠脊髓标本损伤状况以及统计TGF-β1和凋亡细胞的表达。在标本检测中，手术组TGF-β1和凋亡细胞的表达基本表现为先增高后逐步降低的趋势。其中不减压组最为明显，高度表达。回顾国外学者研究文献[3-5]，TGF-β1广泛存在于人血小板和哺乳动物骨骼中，是一类广泛存在的多肽类生长因子，具有多种生物学作用，主要参与组织创伤修复、胚胎发育、免疫、炎症、血管生成和细胞外基质的沉积等密切相关的多功能的细胞因子。近来研究表明[13,14]：TGF-β1与急性脊髓损伤的修复关系密切，在脊髓损伤后表达增加，可能与其具有免疫抑制、炎症抑制的作用相关，是机体对神经损伤的一种自我保护反应。动物实验结果也提示，应用转化生长因子鞘内给药处理急性大鼠脊髓损伤，可以明显减轻脊髓损伤的范围，推断TGF-β1通过抑制胶质瘢痕形成来为脊髓损伤修复提供良好的环境[15]。Yuan等[16]实验表明：大鼠脊髓损伤后TGF-β1、核转录因子NF-κb等促炎因子增加，通过抗炎作用降低细胞内成分胶质纤维酸性蛋白的表达；抑制反应性胶质增生。另外，转化生长因子还具有神经元保护作用的功能，能够促进脊髓运动神经元和多巴胺神经元的存活，可以促血管形成及促进轴突的伸长[17]。Sulaiman等[18]研究也证实，在大鼠胫神经损伤模型中，局部使用TGF-β1对神经元再生有显著效果，证实TGF-β1能抑制T细胞的增生和小胶质细胞、巨噬细胞的细胞毒性分子和炎症前因子的释放，减少炎症引起的组织损伤，促进神经元的损伤修复。

本实验研究结果也表明，在动物实验中，随着脊髓减压时间的推迟，72 h减压组大鼠减压后神经功能恢复水平如BBB评分及斜板评分较早期减压组(8 h减压组和24 h减压组)有明显差异，且TGF-β1的表达也较高。而不减压组大鼠神经功能评分更低，且TGF-β1的表达水平较手术减压组也较高，基本符合以往文献报道[13，16]，可以证实TGF-β1对脊髓损伤的修复有一定的促进作用。

在本实验中，随着脊髓减压时间的推迟，72 h减压组大鼠减压后神经功能恢复水平如BBB评分及斜板评分较早期减压组(8 h减压组和24 h减压组)有明显差异，且凋亡细胞水平也较早期减压组高，TGF-β1的表达也相应较高。同时，在不减压组与减压组的比较中，可见不减压组相同时期内凋亡细胞水平和TGF-β1的表达、BBB评分、斜板评分均显著高于减压组。

在凋亡细胞计数与TGF-β1表达的计数对比中可见：正常脊髓中不表达凋亡细胞和TGF-β1，发生SCI后，机体启动了细胞凋亡程序，同时在脊髓损伤后也立即出现了TGF-β1的表达。经数据分析，证实：各组不同时间减压后，凋亡细胞计数与TGF-β1阳性细胞数存在相关性，且经方差分析后有统计学意义。凋亡细胞计数在减压术后3 d达高峰，后逐渐下降，并持续表达。TGF-β1在3 d达高峰后逐渐下降，并持续表达。在早期减压中，凋亡细胞的峰值水平远低于晚期减压组及不减压组，与Park等[19]的报道结果相符合。对比TGF-β1与凋亡细胞的计数可见：随着TGF-β1表达的增加，凋亡细胞呈进行性下降。故推测，在脊髓损伤凋亡启动后，脊髓损伤处高度表达的TGF-β1可能对凋亡有阻断作用，从而限制凋亡的进一步发展，以保护周围神经元，以此来减轻脊髓损伤的范围。

综上，通过实验研究表明，脊髓损伤大鼠早期(24 h内)有效的脊髓减压对促进神经功能恢复起着至关重要的作用，神经功能评分(斜板评分及BBB评分)明显优于72 h减压组及不减压组。且对比TGF-β1与凋亡细胞的计数可见：随着TGF-β1表达的增加，凋亡细胞呈进行性下降，推测TGF-β1可抑制凋亡的进一步发展，并且具有神经元保护功能。国内外已有报道局部干细胞移植可有效促进神经元的再生[20]，预计可能在不久的将来，应用3D打印技术，移植胶原蛋白/壳聚糖支架来改善神经损伤后轴突再生将是一个新的研究热点。