二甲双胍在对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤中的保护作用

常虎林,房国栋,万 永,刘司南,张靖垚,耿西林*

(1 西安交通大学第三附属医院肝胆外科,西安 710068;2 西北工业大学附属医院肝胆外科;3 西安交通大学第三附属医院病理科;4 西安交通大学第一附属医院肝胆外科;*通讯作者,E-mail:gengxilin-xa@163.com)

对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)是一种临床上广泛应用的解热镇痛药,治疗剂量下APAP安全可靠[1]。近年来,由其过量或不当应用引发的肝脏毒性损伤正呈上升趋势,成为药物诱导肝损伤及急性肝功能衰竭的主要原因[2]。据统计在美国约一半的急性肝衰竭是由APAP服用过量引起的,我国急性药物性肝损伤住院患者也逐年递增[2]。临床上有洗胃、APAP解毒剂应用、营养支持等治疗方式,严重者考虑肝移植。现有研究结果表明,高剂量的APAP会使葡萄糖醛酸化和硫酸化途径饱和,产生过量的NAPQI[3],超出体内还原型谷胱甘肽(GSH)系统的清除能力,从而反应性增加活性氧(reactive oxygen species, ROS)的积累,触发c-Jun-N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的磷酸化,JNK的持续激活在APAP诱导肝细胞死亡中起到核心作用[4]。

二甲双胍(metformin, MET)是目前临床常用的治疗2型糖尿病的药物之一。近年来的研究还发现MET可用于多囊卵巢综合征、肥胖、心力衰竭和高血压等疾病的治疗[5]。同时,有报道称MET对非酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝、CCl4或甲氨蝶呤引起的肝中毒反应均有保护作用[5-9]。但是,MET对APAP诱发的急性药物性肝损伤是否发挥保护作用尚待研究。

本研究中,我们应用APAP肝损伤动物模型,研究了MET对APAP诱导的急性肝损伤的保护作用,并初步探索了这种保护作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

6-8周C57BL/6雄性小鼠由陕西省人民医院实验中心提供。二甲双胍(格华止,国药准字H20023371),由上海施贵宝制药有限公司提供。JNK羊抗鼠单克隆抗体和p-JNK羊抗鼠单克隆抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供;TNF-α和IL-6检测试剂盒由深圳达科为生物技术有限公司提供。RIPA裂解液由上海碧云天生物技术有限公司提供。APAP溶液的配制(将0.7 g APAP粉剂溶于100 ml生理盐水中,在40 ℃水浴锅中晃动充分溶解、混匀,按350 mg/kg剂量给药准备)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制作和实验分组 6-8周龄BALB/c雄性小鼠(22-25 g)30只随机平均分为3组:①空白对照组(control组);②药物性肝损伤组(APAP组),腹腔内注射350 mg/kg APAP溶液,作用24 h;③二甲双胍处理组(APAP+MET组),于APAP暴露前30 min腹腔注射MET 400 mg/kg,后给予APAP溶液,作用24 h;各组小鼠均在APAP暴露24 h后处死,及时采集血液样本和肝组织样本。

1.2.2 血清ALT、AST水平的测定 根据谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒,测定血清ALT、AST水平。

1.2.3 肝组织病理学检查 取出分离后的肝脏组织利用4%甲醛溶液固定,常规苏木精-伊红(HE)染色,观察肝组织病理学改变。

1.2.4 炎症相关因子的测定 根据ELISA检测试剂盒说明书指示,测定血清TNF-α、IL-6含量。

1.2.5 c-Jun-N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的表达测定 精密称取各组小鼠肝组织,根据RIPA裂解液使用说明书制备肝组织匀浆,肝组织与RIPA裂解液的比例为1 mg ∶7.5μl,用玻璃匀浆器上下、旋转充分碾磨。在冰上裂解25 min后,14 000g离心30 min,取上清,利用Western blot检测各组小鼠肝组织p-JNK/JNK(稀释比1 ∶800)表达的变化,应用β-actin作为内参校正。

2 结果

2.1 MET对APAP诱导急性肝损伤小鼠AST、ALT的影响

与对照组相比,APAP组小鼠血清AST和ALT水平显著升高,差异均有统计学意义(t分别为19.95,11. 16,均P<0.05)。而APAP+MET组AST、ALT水平明显低于APAP组,差异均有统计学意义(t分别为12.31,12.83,P<0.05,见图1)。

2.2 MET对APAP诱导急性肝损伤肝组织病理改变的影响

与对照组相比,APAP诱导肝损伤小鼠肝组织内可见肝小叶结构模糊,肝索排列紊乱,形态失常,肝窦内多发炎性细胞浸润,正常的肝组织结构明显破坏;而上述改变在APAP+MET组小鼠中得到缓解(见图2)。

2.3 MET对APAP诱导急性肝损伤炎症因子水平的影响

用ELISA法检测各组小鼠的TNF-α和IL-6的水平,结果显示,APAP组TNF-α和IL-6水平均较空白对照组明显升高,差异均有统计学意义(t分别为27.97,8.25,均P<0.05);相较于APAP组,APAP+MET组TNF-α和IL-6水平明显下降,差异均有统计学意义(t分别为16.20,11.44,均P<0.05,见图3)。

与空白对照组比,* P <0.05;与APAP组相比,#P <0.05图1 MET处理对APAP诱导急性肝损伤AST、ALT的影响Figure 1 Effect of MET on AST and ALT levels in APAP-induced acute liver injury mice

图2 MET处理对APAP诱导急性肝损伤肝组织病理改变的影响 (HE染色,×200)Figure 2 Effect of MET on pathological changes in APAP-induced acute liver injury mice (HE staining,×200)

与空白对照组相比,* P <0.05;与APAP组相比,#P <0.05图3 MET处理对APAP诱导急性肝损伤血清TNF-α和IL-6水平的影响Figure 3 Effect of MET on the serum TNF-α and IL-6 levels in APAP-induced acute liver injury mice

2.4 MET通过减少JNK磷酸化减轻APAP致肝损伤

用Western blot法检测小鼠肝组织匀浆内p-JNK、JNK的表达,应用β-actin内参校正后,空白对照组、APAP组和APAP+MET组肝组织内JNK含量差异无统计学意义。与空白对照组相比,APAP组肝组织内p-JNK含量明显增多,差异有统计学意义(t=9.49,P<0.05);而APAP+MET组小鼠肝组织内p-JNK含量较APAP组明显减少,差异有统计学意义(t=8.79,P<0.05,见图4)。

与对照组相比,* P <0.05;与APAP组相比,#P <0.05图4 MET对APAP致肝损伤小鼠p-JNK/JNK的影响Figure 4 Effect of MET on the expression of p-JNK/JNK in liver tissue

3 讨论

肝脏是药物在人体中代谢和清除的部位,药物导致的肝损伤近年来备受关注。APAP作为其中被研究最多的药物之一,其过量摄入可导致严重的肝脏损伤,甚至急性肝衰竭[1]。现有研究结果发现APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型中,坏死的肝细胞释放损伤相关分子模式(damage-associated mole-cular patterns, DAMPs),DAMPs则可被肝内中性粒细胞等识别,并使得这些炎性细胞被激活[10],进一步释放各种炎性因子如TNF-α和IL-6,从而加重炎症反应及细胞损伤。炎症反应被认为是APAP致急性肝损伤的基本机制之一。

MET作为临床治疗2型糖尿病的一线药物,具有良好的安全性和性价比。MET主要通过抑制肝糖原新生、调节胰岛素受体信号等方式调节血糖。临床研究发现可以通过抑制炎症反应等方式来减轻急性呼吸窘迫综合征、肠道缺血再灌注损伤、脑脊髓炎等疾病的组织损伤[11-13]。本研究中,我们尝试探讨MET在APAP诱导肝损伤的潜在作用。实验发现MET可显著降低模型小鼠血浆中转氨酶水平的异常升高并对肝组织病理学损伤有所改善,同时炎症相关因子TNF-α和IL-6的表达也明显受抑,以上结果证实MET在APAP肝损伤中具有抗损伤和抗炎作用。

JNK已被证实在多种组织器官(包括肝脏)的损伤、应激、细胞生存与凋亡等方面起着重要调节作用。Gunawan等[14]通过小鼠和体外细胞培养的研究发现在APAP导致的肝损伤中JNK被持续激活,并且发现JNK抑制剂SP600125在体外和体内对APAP肝毒性有显著的保护作用。Win等[15]研究发现,沉默JNK在线粒体膜上结合位点Sab,可抑制JNK的持续激活和JNK在线粒体膜上定位,对APAP诱导的肝脏损伤起到保护作用。因此MET能否通过抑制JNK的激活对急性肝损伤发挥保护作用值得进一步探讨。本研究中,与空白对照组比较,Western blot结果显示APAP致肝损伤时JNK的磷酸化明显增多。而MET干预后,p-JNK的表达含量又比APAP组明显减少,提示MET预处理可减少APAP致肝损伤时JNK的磷酸化。

本研究证实了MET通过抑制JNK的磷酸化对APAP诱导急性肝损伤发挥保护作用。提示二甲双胍具有治疗急性肝损伤的潜在价值,并为其治疗提供新的理论依据。但JNK信号调控网相当复杂,更全面的分子机制仍需进一步深入研究。