大豆苷元在鉴别何首乌不同炮制品种中的应用研究Δ

马建文，冯 伟

(1.新疆医科大学附属中医医院药剂科，新疆 乌鲁木齐 830000； 2.乌鲁木齐市妇幼保健院药剂科，新疆 乌鲁木齐 830000)

何首乌有生何首乌和制何首乌之分。生何首乌具有解毒、润肠通便和消痈等功效[1]。制何首乌具有清热解毒、补血养肾等功效[2]。研究结果表明，黑豆可增强和改变生何首乌的疗效[3]。目前，何首乌炮制时间与制何首乌质量检测尚未有明确规定，导致市场流通的制何首乌大多未按照标准进行炮制或添加人工色素以达到外观要求，内在质量悬殊[4]。黑豆汁制何首乌与清蒸何首乌仅从外观性状上难以进行准确鉴定，多通过检测二苯乙烯苷类和蒽醌类化合物的含量鉴别其质量[5]。二苯乙烯苷类和蒽醌类化合物在何首乌炮制过程中含量不稳定，易挥发或分解[6]。近年来，有研究在黑豆汁制何首乌中检测出了大豆苷元[7]。本研究探讨了大豆苷元在鉴别不同何首乌炮制品中的应用，现报告如下。

1 材料

1.1 仪器

XS101型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，精度0.01 mg/0.1 mg)；DHG-9 240 A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣机械有限公司)；硅胶板G高效板(青岛海洋化工厂分厂)；1220型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

1.2 药品与试剂

生何首乌购于湖北道地药材科技有限公司；大豆苷元购自中国药品生物制品鉴定所，批号为111502-200402；黑豆、二苯乙烯苷、大黄素及大黄素甲醚购自中国食品药品检定研究院，批号分别为120975-201707、110844-201109、110756-200110及110758-20101。

2 方法

2.1 何首乌的制备

由新疆医科大学附属中医医院制剂科制备。(1)生何首乌：电子天平称取生何首乌100.00 g，置于电热恒温鼓风干燥箱干燥处理，研磨备用。(2)清蒸何首乌：电子天平称取生何首乌100.00 g，置于陶瓷容器内坐水锅中隔水炖制24 h，取出置于电热恒温鼓风干燥箱干燥处理，研磨备用。(3)黑豆汁制何首乌：参照相关文献[8]中的方法进行炮制，电子天平称取黑豆1 000.00 g，置于锅内加水煎煮4 h；滤网过滤取滤液，剩余豆渣加纯净水5 000.00 g煎煮3 h；滤网过滤取滤液，合并2次滤液，称取生何首乌400.00 g搅拌均匀，置于陶瓷容器内坐水锅中隔水炖制24 h，取出置于电热恒温鼓风干燥箱干燥处理，研磨备用。

2.2 溶液的制备

(1)供试品溶液：分别取“2.1”项下3种何首乌粉末2 g，加无水乙醇-盐酸混合溶液(V∶V=4∶ 1)40 ml，称定质量，水浴加热回流提取1 h，放冷至室温(25 ℃)，再称定质量，并用上述无水乙醇-盐酸混合溶液补足损失的溶剂量，滤过，滤液浓缩至适量，蒸干；残渣中精密加入20 ml水溶解；加入乙酸乙酯溶液(30 ml)萃取3次，每次10 ml，合并3次萃取液；萃取液浓缩至10 ml，加在聚酚(酰)胺柱上，以50 ml水洗脱，弃去水洗脱液；再以50 ml乙醇洗脱，收集洗脱液；洗脱液浓缩至适量，蒸干，残渣中加入甲醇溶液2 ml使溶解，即可。(2)对照品溶液：分别取大豆苷元、黑豆、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚加入甲醇混匀后制成质量浓度为0.5 mg/ml的对照品溶液。

2.3 薄层色谱(thin layer chromatography，TLC)分析

吸取供试品溶液4 μl和对照品溶液2 μl，点于同一硅胶板G高效板(10 cm×10 cm)；将氯仿和无水乙醇以体积比10∶ 1.2混合，滴加至薄层板上作为展开剂，取出晾干，紫外光灯(365 nm)下检视。

2.4 高效液相色谱(high performance liquid chromato-graphy，HPLC)分析

采用1220型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液-乙腈(V∶V∶V=2∶ 6∶ 2)，柱温为25 ℃，流速为8.0 ml/min，测定波长为254 nm(大豆苷元、大黄素及大黄素甲醚)、320 nm(二苯乙烯苷)，进样量为15 μl。

(1)大豆苷元:吸取对照品溶液0.1 ml加入流动相稀释至69.6 μg/ml，经滤膜(0.45 μm)过滤后进行色谱分析；(2)黑豆:吸取对照品溶液0.2 ml加入流动相稀释至139.4 μg/ml，经滤膜过滤后进行色谱分析；(3)二苯乙烯苷:吸取对照品溶液0.8 ml加入流动相稀释至278.8 μg/ml，经滤膜过滤后进行色谱分析；(4)大黄素:吸取对照品溶液1.6 ml加入流动相稀释至557.6 μg/ml，经滤膜过滤后进行色谱分析；(5)大黄素甲醚:吸取对照品溶液3.2 ml加入流动相稀释至1 115.2 μg/ml，经滤膜过滤后进行色谱分析。

2.5 重复性试验

取供试品溶液各6份，按照“2.4”项下方法进样，观察并记录各成分峰面积，计算相对标准偏差(RSD)，RSD≤3.0%提示重复性好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，于室温下分别放置0、5、10、20、30和48 h后按照“2.4”项下方法进样，观察并记录各成分峰面积，计算RSD，RSD≤2.0%提示稳定性好。

2.7 精密度试验

吸取对照品溶液10 μl，按照“2.4”项下方法连续进样6次，观察并记录各成分峰面积，计算RSD，RSD≤2.0%提示精密度好。

2.8 加样回收率试验

取已知成分含量的供试品溶液各6份，分别精密加入一定量的对照品后按照“2.4”项下方法进样，根据峰面积计算含量，得出平均加样回收率和RSD，RSD≤3.0%提示回收率佳。

3 结果

3.1 供试品与对照品TLC分析结果

黑豆汁制何首乌溶液色谱中在与黑豆对照品和大豆苷元对照品相应位置上显示相同颜色荧光斑点，生何首乌、清蒸何首乌溶液色谱中未显示相同颜色荧光斑点，见图1。

1.生何首乌；2.黑豆汁制何首乌；3.大豆苷元对照品；4.黑豆对照品；5.清蒸何首乌1. raw polygonum multiflorum; 2. polygonum multiflorum made from black bean juice; 3. reference substance of isoflavoues aglycone; 4. reference substance of black bean; 5. steamed polygonum multiflorum图1 何首乌不同炮制品种与对照品的TLC图Fig 1 TLC diagrams of reference substance and different processed varieties of polygonum multiflorum

3.2 供试品与对照品HPLC分析结果

生何首乌色谱上出现与二苯乙烯苷和大黄素相同特征峰，未出现与大豆苷元、黑豆和大黄素甲醚相同特征峰，见图2—3；清蒸何首乌色谱上出现与二苯乙烯苷、大黄素及大黄素甲醚相同特征峰，未出现与大豆苷元和黑豆相同特征峰，见图2、4；黑豆汁制何首乌色谱上出现与大豆苷元、黑豆、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚相同特征峰，见图2、5。

A.大豆苷元对照品；B.黑豆对照品；C.二苯乙烯苷对照品；D.大黄素对照品；E.大黄素甲醚对照品A. reference substance of isoflavoues aglycone; B. reference substance of black bean; C. reference substance of stibene glucoside; D. reference substance of emodin; E. reference substance of physcion图2 对照品溶液的HPLC图Fig 2 HPLC diagram of reference solution

3.3 线性关系考察结果

大豆苷元进样量在1.479～18.782 μg范围内与对应色谱峰面积积分值存在线性关系；二苯乙烯苷进样量在0.942～18.364 μg范围内与对应色谱峰面积积分值存在线性关系；大黄素进样量在0.235～2.672 μg范围内与对应色谱峰面积积分值存在线性关系；大黄素甲醚进样量在0.514～5.336 μg范围内与对应色谱峰面积积分值存在线性关系，见表1。

表1 线性关系考察结果Tab 1 Inspection results of linear relationship

3.4 何首乌不同炮制品中各成分含量测定结果

生何首乌和清蒸何首乌供试品溶液中未检测出大豆苷元。黑豆汁制何首乌大豆苷元含量高于生何首乌和清蒸何首乌，二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚含量低于生何首乌和清蒸何首乌，见表2。

表2 何首乌不同炮制品中各成分含量测定结果(n=3，mg/g)Tab 2 Determination results of various components in different processed products of polygonum multiflorum(n=3, mg/g)

3.5 重复性、稳定性及精密度考察结果

大豆苷元、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚重复性的RSD≤3.0%，稳定性的RSD≤2.0%，精密度的RSD≤2.0%，见表3。

表3 重复性、稳定性及精密度考察结果(%，n=6)Tab 3 Inspection results of repeatability, stability and precision (%, n=6)

3.6 加样回收率试验结果

大豆苷元、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的平均回收率均>95%，见表4。

表4 加样回收率考察结果(%，n=6)Tab 4 Inspection results of adding sample recovery (%, n=6)

4 讨论

生何首乌味苦涩、色黄白，主要含蒽醌类化合物和二苯乙烯苷[9]。游离蒽醌衍生物可促进胆固醇代谢，具有抑制肠道对胆固醇再吸收的作用[10]；结合蒽醌可促进肠管蠕动，具有泻下作用[11]；二苯乙烯苷衍生物具有降胆固醇和保肝作用[12]。历代文献中，制何首乌的临床应用多于生何首乌[13]。近代制何首乌炮制方法有熟地汁蒸、黑豆生姜汁煮等，而黑豆汁制何首乌方法从唐代沿用至今，应用历史长[14]。HPLC法为目前药物杂质检查常用手段[15]。以往，多通过HPLC法测定何首乌中大黄素、大黄素甲醚和二苯乙烯苷含量来检测其质量[16]。但多项研究结果显示，生何首乌经炮制后二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚的含量可减少[17-18]。《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)中指出，大豆苷元为黑豆质量控制的主要指标成分。邓青等[7]从黑豆汁制何首乌中检测出了大豆苷元。

A.大豆苷元；B.二苯乙烯苷；C.大黄素；D.大黄素甲醚A. isoflavoues aglycone; B. stilbene glucoside; C. emodin; D. physcion图3 生何首乌溶液的HPLC图Fig 3 HPLC diagram of raw polygonum multiflorum

A.大豆苷元；B.二苯乙烯苷；C.大黄素；D.大黄素甲醚A. isoflavoues aglycone; B. stilbene glucoside; C. emodin; D. physcion图4 清蒸何首乌溶液的HPLC图Fig 4 HPLC diagram of steamed polygonum multiflorum

A.大豆苷元；B.二苯乙烯苷；C.大黄素；D.大黄素甲醚A. isoflavoues aglycone; B. stilbene glucoside; C. emodin; D. physcion图5 黑豆汁制何首乌溶液的HPLC图Fig 5 HPLC diagram of polygonum multiflorum made from black bean juice

本研究中TLC分析结果显示，黑豆汁制何首乌溶液色谱中在与黑豆对照品和大豆苷元对照品相应位置上显示相同颜色荧光斑点，生何首乌、清蒸何首乌溶液色谱中未显示相同颜色荧光斑点，提示经黑豆汁炮制后何首乌中存在大豆苷元成分，与邓青等[7]的研究结果一致。HPLC分析结果显示，各待测成分出峰情况和分离效果较好，生何首乌色谱上出现与二苯乙烯苷和大黄素相同特征峰，未出现与大豆苷元、黑豆和大黄素甲醚相同特征峰；清蒸何首乌色谱上出现与二苯乙烯苷、大黄素及大黄素甲醚相同特征峰，未出现与大豆苷元和黑豆相同特征峰；黑豆汁制何首乌色谱上出现与大豆苷元、黑豆、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚相同特征峰，提示炮制后何首乌中有效成分有所改变，符合以往研究结果[19-20]，同时说明大豆苷元可作为鉴别黑豆汁制何首乌和生首乌、清蒸何首乌的指标。本研究结果表明，大豆苷元、二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚进样量在一定范围内与对应色谱峰面积存在线性关系，提示HPLC法中流动相洗脱效果较高，不同极性物质保留时间和峰面积存在差异，有利于对何首乌中各成分鉴定。通过对供试品溶液各成分定量分析得出，黑豆汁制何首乌大豆苷元含量高于生何首乌和清蒸何首乌，二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚含量低于生何首乌和清蒸何首乌；生何首乌和清蒸何首乌供试品溶液中未检测出大豆苷元，进一步证实大豆苷元含量测定对制首乌质量控制具有推广应用价值。本研究中，HPLC法对检测黑豆汁制何首乌中大豆苷元含量具有较好的重复性、稳定性、精密度以及可靠性，但实施过程中需严格控制受试品进样量。

综上所述，经炮制的何首乌中有效成分含量可发生改变，大豆苷元含量可作为黑豆汁制何首乌与其他炮制工艺何首乌的鉴别与质量控制的检测指标。