四价流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量高效液相色谱检测方法的建立、验证及与比浊法的对比

樊雪，吴铮，王一平，李璇，周荔葆

辽宁成大生物股份有限公司研发部，辽宁沈阳110179

四价流感病毒裂解疫苗系用甲型和乙型流感病毒株（每型各两种病毒株型）接种于鸡胚培养适宜时间后，收获病毒液，再经病毒灭活、纯化、裂解等工艺步骤后配制而成。在临床上用于预防由这4种病毒株型导致的流行性感冒。在生物制品生产工艺过程中，常将Triton X-100作为裂解剂或灭活剂，而Triton X-100本身具有一定的刺激性，残留的Triton X-100需在后续纯化工艺步骤中去除［1-2］。在流感病毒裂解疫苗生产工艺过程中，加入了Triton X-100对病毒进行裂解［3］，后续工艺中可能会有部分残留，《中国药典》三部（2015版）对其残留量进行了明确的规定［4］，因此，需对其工艺过程中的Triton X-100残留量进行检测。《中国药典》三部（2015版）“重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）”项下的Triton X-100残留量检测采用的是比浊法，将标准品和供试品与苯酚反应，生成具有一定浊度的复合物，其浓度与吸光度值正比［5］。但比浊法的专属性、灵敏度、准确度较差，要求供试品本身没有浊度，否则将会干扰测定。而高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）具有较高的专属性、灵敏度、精密度和准确度［6-7］。

本研究建立了适用于四价流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量检测的HPLC法，对方法进行验证，并与比浊法进行对比［8］，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 疫苗原液 流感病毒裂解疫苗原液（批号：2018-1225、20181226、20181227）由辽宁成大生物股份有限公司制备。

1.2 主要试剂及仪器 甲醇（批号：126273）购自美国Fisher公司；Triton X-100（批号：100M01281V）购自美国Sigma公司；苯酚（批号：20160725）购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；高效液相色谱仪（LC-2010A）购自日本SHIMADZU公司；色谱柱BDS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5μm）购自美国Thermo公司；紫外可见分光光度计（ultrospec 2100 pro）购自美国Amersham Biosciences公司。

1.3 HPLC法的建立及验证

1.3.1 色谱条件的筛选

1.3.1.1 流动相比例的筛选 选择流动相水∶甲醇比例分别为30∶70、20∶80、10∶90，考察Triton X-100在色谱柱上的保留。

1.3.1.2 流速的筛选 选择流速分别为1.0、1.2、1.4 mL／min，考察待测物保留行为。

1.3.1.3 进样量的筛选 选择进样量分别为5、10、20μL，考察待测物保留行为。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 Triton X-100对照品储备液 精密称取Triton X-100对照品100 mg，放置于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，得到浓度为1 000μg／mL的对照品储备液。

1.3.2.2 工作溶液 精密量取1 000μg／mL的Triton X-100储备液1、0.5、0.2、0.1 mL至10 mL容量瓶中，定容，得到浓度为100、50、20、10μg／mL的对照品工作溶液。精密量取10μg／mL的Triton X-100工作溶液5、2、1 mL至10 mL容量瓶中，定容，得到浓度为5、2、1μg／mL的对照品工作溶液。

1.3.3 方法的验证

1.3.3.1 系统适用性和专属性 取10μg／mL的对照品溶液，按照确定的色谱条件进样6次，记录色谱图，测定理论塔板数和分离度。同时记录空白溶液和供试品溶液色谱图。

1.3.3.2 线性及范围 取2、5、10、20、50、100μg／mL的对照品工作溶液，按照确定的色谱条件进样，考察线性和范围。以各样品测得的峰面积（A）为纵坐标，加入对照品溶液浓度（C）为横坐标，进行线性回归。

1.3.3.3 准确性 精密量取供试品（批号：20181225）9份，每份1 mL，分别精密加入Triton X-100对照品，配制成8、10、12μg／mL的加标样品，每个浓度各3份，按照确定的色谱条件进样。计算回收率。

1.3.3.4 精密性 精密量取供试品（批号：20181225）6份，每份1 mL，精密加入Triton X-100对照品，配制成10μg／mL的加标样品，按照确定的色谱条件进样，计算Triton X-100峰面积的RSD，验证方法的重复性。另一名试验员在第2天同法操作，验证方法的中间精密性。

1.3.3.5 定量限及检测限 逐步稀释10μg／mL的Triton X-100对照品溶液，按照确定的色谱条件进样，确定该方法的定量限及检测限。

1.3.3.6 耐用性 考察色谱柱温度（30±2）℃，流动相流速（1.2±0.1）mL／min的耐用性。分别取10μg／mL的对照品工作液进样6次，计算RSD和相对误差（RE）。

1.4 比浊法的验证

1.4.1 溶液的配制 取含量为100μg／mL的对照品工作溶液，配制成浓度为10、20、40、60、80μg／mL的工作溶液。

1.4.2 方法的步骤 参照《中国药典》三部（2015版）“重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）”项下检测方法，取供试品2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，充分反应后在340 nm波长处测定吸光度值。

1.4.3 方法的验证

1.4.3.1 线性和范围 取10、20、40、60、80、100μg／mL对照品系列工作溶液2 mL于试管中，每个浓度取2份，每管分别加入5%苯酚溶液1 mL，迅速涡旋振荡，室温放置15 min。以生理盐水作为空白对照，在波长340 nm处测定吸光度值。以对照品溶液中Triton X-100的含量对其吸光度值做线性回归，计算相关系数。

1.4.3.2 准确性 精密量取供试品（批号：20181225）9份，分别精密加入低、中、高3个浓度的Triton X-100对照品工作溶液，配制成20、40、80μg／mL的加标样品，每个浓度各3份，按照1.4.2.1项步骤进行分析。并计算回收率。

1.4.3.3 精密性 精密量取供试品（批号：20181225）6份，每份2 mL，按照1.4.2.1项步骤进行分析。将供试品的吸光度值带入标准曲线中进行计算得到样品含量，并计算RSD，验证方法的重复性。另一名试验员在隔天同法操作，精密量取供试品6份，计算RSD，验证方法的中间精密性。

1.4.3.4 定量限 将10μg／mL的定量限工作溶液按照1.4.2.1项步骤进行6次平行试验，计算RSD。

1.5 两种方法的对比

1.5.1 方法学对比 将HPLC法与比浊法的主要方法学验证结果进行对比。

1.5.2 供试品Triton X-100残留量测定结果对比取流感病毒裂解疫苗原液3批供试品，按照确定的色谱条件进样分析，记录峰面积，计算Triton X-100残留量。同时将这3批供试品采用比浊法，按照

1.4.2.1 项步骤进行分析，测定Triton X-100残留量。

2 结果

2.1 HPLC法的建立及验证

2.1.1 色谱条件的确定

2.1.1.1 流动相比例 甲醇占70%时，难以将待测物洗脱下来，且色谱峰宽，柱效低；甲醇占80%和90%时，待测物洗脱峰型良好，对称性和柱效符合分析检测的要求。综合考虑节约有机相的使用等因素，最终选择流动相比例为水∶甲醇=20∶80。

2.1.1.2 流速 流速为1.0 mL／min时，色谱峰展宽，对称性和柱效不理想；流速为1.2 mL／min时，待测物洗脱峰对称性良好，对称性和柱效符合分析检测的要求；流速为1.4 mL／min时，柱压较高，可能影响色谱柱和色谱仪的使用寿命。最终选择流速为1.2mL／min。

2.1.1.3 进样量 进样量为5μL时，灵敏度低，检测限和定量限不能满足要求；进样量为20μL时，由于待测物黏度大，造成色谱峰难以洗脱，峰拖尾。最终选择进样量为10μL，符合定量检测的要求。

2.1.1.4 色谱条件 采用ODS C18反相色谱柱，型号规格为：BDS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：超纯水∶甲醇=20∶80；流速：1.2 mL／min；检测波长：230 nm；进样量：10μL；柱温：30℃；运行时间：12 min。

2.1.2 方法的验证

2.1.2.1 系统适用性和专属性 空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1。Triton X-100色谱峰的理论塔板数不低于3 000，分离度大于1.5，表明杂质对测定无干扰，方法的系统适用性和专属性良好。

图1 空白溶剂（A）、对照品溶液（B）、供试品溶液（C）的高效液相色谱图Fig.1 HPLC profile of blank solvent（A），control solution（B）and test sample solution（C）

2.1.2.2线性和范围 回归方程为Y=6 478.21X+2 449.11，r=0.999 9。Triton X-100在2～100μg／mL浓度范围内，线性关系良好。

2.1.2.3 准确性 不同加标样品的回收率均在95%～105%之间，见表1。表明该方法准确性良好。

表1 HPLC准确性验证结果Tab.1 Verification for accuracy of HPLC

2.1.2.4 精密性 重复性和中间精密性试验的RSD分别为2.8%和3.9%，均小于5%，表明该方法重复性和中间精密性良好。

2.1.2.5 定量限及检测限 测得Triton X-100的定量限为2μg／mL（S／N＞10），检测限为1μg／mL（S／N＞3），RSD分别为3.5%和5.2%，均小于10%。

2.1.2.6 耐用性 经计算，色谱柱温度（30±2）℃，流动相流速（1.2±0.1）mL／min的RSD均小于5%，RE在90%～110%之间，见表2。表明该方法耐用性良好。

表2 HPLC耐用性验证结果（%）Tab.2 Verification for durability of HPLC（%）

2.2 比浊法的验证

2.2.1 线性和范围 回归方程为Y=0.011 8X+0.1542，r=0.996 5。Triton X-100在10～100μg／mL浓度范围内，线性关系良好。

2.2.2 准确性 不同加标浓度样品的回收率在85%～115%之间，见表3。表明该方法准确性良好。

表3 比浊法准确性验证结果（%）Tab.3 Verification for accuracy of turbidimetric method（%）

2.2.3 精密性 重复性和中间精密性试验的RSD分别为5.8%和7.2%，均小于10%，表明该方法重复性和中间精密性良好。

2.2.4 定量限6次平行试验的RSD为10.2%，小于15%。

2.3 两种方法的对比

2.3.1 方法学对比结果HPLC法方法学的主要验证结果均优于比浊法，见表4。

表4 HPLC法与比浊法方法学主要验证结果对比Tab.4 Methodological verification of HPLC and turbidimetric method

2.3.2 供试品Triton X-100残留量测定结果对比HPLC法测定3批供试品Triton X-100残留量均＜2μg／mL，比浊法测定3批供试品Triton X-100残留量均＜10μg／mL。

3 讨论

四价流感病毒裂解疫苗采用鸡胚培养，Triton X-100是适合用于裂解流感病毒的裂解剂，广泛应用于市售流感病毒裂解疫苗的裂解工艺中［9-12］。而Triton X-100是一种非离子表面活性剂，其浓度达到0.1%时能破坏生物膜，使细胞溶解破坏，还可能引起人体过敏反应［13］，因此对其残留量应严格控制。四价流感病毒裂解疫苗的抗原为血凝素，其成分中蛋白质含量较高，对Triton X-100残留量的检测可能产生干扰，因此本实验考察了不同方法检测Triton X-100的适用性。

由于Triton X-100的黏度大，对反相色谱柱吸附较大难以洗脱，易造成色谱峰展宽，因此本实验考察了HPLC法的流动相比例（水∶甲醇=30∶70、20∶80、10∶90）、流速（1.0、1.2、1.4 mL／min）、进样量（5、10、20μL）等条件。综合考虑色谱柱的柱压力和使用寿命，最终选择了超纯水∶甲醇=20∶80、流速1.2 mL／min、进样量10μL、检测波长230 nm为最佳条件，在此条件下，色谱的柱效较高，能够满足定量分析的需要。

将相同样品采用HPLC法和比浊法进行对比测定，结果显示，HPLC法的专属性好，线性良好（r=0.999 9）、准确性较高（回收率99.3%）、精密性良好（RSD<5%），各项验证结果均优于比浊法。且当供试品本身蛋白含量较高，有乳浊色时，比浊法不适用。比浊法的定量限为10μg／mL，HPLC法的定量限为2μg／mL。因此，HPLC法具有更大的优势。

综上所述，本实验建立的测定流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量的HPLC法，具有良好的专属性、线性、准确性、精密性和耐用性，试验结果稳定可靠，适用于流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量的检测。