利用实时荧光定量PCR法测算红螯螯虾实体组织的细胞数量

郑在超，李 钫，杨 丰

(自然资源部第三海洋研究所、海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 361005)

在生物学和医学的研究中，细胞数量是一个常用的生理指标。例如，在人类疾病研究中，血细胞数量被用作贫血和炎症的指标[1]，血液循环中的肿瘤细胞数目[2]和浸润在组织中的肿瘤细胞数目[3]被作为癌症检测的重要指标。在微生物研究中，藻类[4]和细菌[5]的数量被作为环境监测指标。而在水产动物的研究中，循环血细胞数量是评估甲壳动物[6]、软体动物[7]、鱼类[8]等的免疫状态的指标。

细胞计数的常见方法有直接法和间接法。直接法即直接对细胞群进行计数，例如，血球计数板法是将细胞悬液滴在划有方格的玻璃上通过镜检计数[9]；连续稀释法是将菌液稀释涂布后对单菌落进行计数[10]；电子细胞计数仪是基于库尔特计数原理，在细胞通过充满电解质的测定管后，根据电阻的变化计算细胞直径，最后统计出给定大小的细胞数目[11]；流式细胞仪可以将单个细胞一一分开分别测定荧光值等指标并进行计数[12]。间接法中，可以根据菌液浊度估算细胞数量[9]；MTT法利用3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]被活细胞中的琥珀酸脱氢酶氧化为蓝色的甲臜，再加入二甲基亚砜(DMSO)溶解并测定其光吸收值来估算活细胞数量[13]。虽然细胞计数的方法种类繁多，但是上述方法均不适合用于直接测定实体组织的细胞数。对于实体组织而言，通常需要利用胶原酶[14]、胰蛋白酶[15]，或纤维素酶[16]等将块状组织消化为单细胞悬液再进行计数，而这个方法也并不适用于所有实体组织，且操作繁琐，组织消化的充分程度直接影响准确性。

实时荧光定量PCR(Real-Time Fluorescence Quantitative PCR， qPCR)可用于定量分析特定基因的拷贝数[17]，因此，这一方法被广泛用于病毒[18]、细菌[19]等微生物数量的测定。虽然这个方法较少用于动植物细胞计数，但确有学者通过qPCR检测特定基因来评估血液和组织中某些特殊的细胞的含量[20]。

在对螯虾、对虾、蟹类等养殖甲壳动物的研究中，研究者多以实体组织的整体为单位来评价病原的感染增殖或分析宿主和病原基因的表达。实际上不同组织的细胞含量存在较大差异，因此，在进行组织间比较时，整体组织水平的检测无法完全反映单细胞水平的情况。此外，病原感染、外伤等外界刺激也有可能引起实体组织中细胞数量的改变，目前尚未有合适的方法对此进行定量分析。

本研究建立了基于基因拷贝数的红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)细胞数量测定方法。该方法以beta-actin基因为目标基因，以已知数量的血细胞为标准样，通过qPCR测定实体组织的细胞数量，具有方便快捷和高通量的优点。

1 材料和方法

1.1 实验动物

红螯螯虾购自汕头纪雄水产有限公司，饲养于25 ℃左右环境中，隔天喂食换水，实验前暂养一个月左右，检测未见虾类常见病原。

1.2 基因克隆和测序

根据beta-actin(GenBank登录号: MN396754.1)和GAPDH(GenBank登录号: KM538172.1)两个基因的mRNA序列设计引物(表1)。使用天根生化科技(北京)有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取螯虾鳃组织DNA。使用Takara公司的PrimeSTAR HS试剂盒进行PCR。PCR程序设置为98 ℃变性15 s，55 ℃/58 ℃(GAPDH/beta-actin)退火5 s，72 ℃延伸120 s，共25个循环。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳分离，明亮的条带切胶回收后委托铂尚生物技术有限公司测序。

1.3 qPCR引物设计

根据所获得的两个基因的DNA序列，设计qPCR引物(表1)，使一对引物中的一条位于内含子区，一条位于外显子区。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.4 样品制备

1.4.1 标准样品制备 取3只红螯螯虾，分别抽取约2 mL血淋巴；用Orfol公司的Moxi Z细胞计数仪测定血细胞数目。从每一份样品中取5×106个血细胞，按“1.2”所述方法提取基因组DNA。然后取相当于1×105、1×104、1×103、1×102、1×10个血细胞的DNA样品作为qPCR的标准模板，共有来源于3只不同螯虾的3组样品。

1.4.2 待测样品制备 取10 mg鳃或肝胰腺组织，按“1.2”所述方法提取基因组DNA，产物用100 μL无菌水溶解，取2 μL (相当于0.2 mg组织的DNA)作为qPCR模板。

1.5 qPCR(染料法)

使用TOYOBO的SYBR® Green Realtime PCR Master Mix试剂盒和Applied Biosystems StepOneTMqPCR仪。反应体系中含DNA模板2 μL，正反向引物(10 μmol/L) 各1 μL，去离子水6 μL，PCR预混液10 μL。反应程序为：95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。

1.6 扩增效率分析

取3只红螯螯虾，按“1.4”所述方法分别制备血细胞、鳃和肝胰腺组织的基因组DNA样品。取相当于1×105个血细胞，或者相当于0.2 mg鳃和肝胰腺组织的基因组DNA。每个样品制备成：原浓度、10倍稀释、100倍稀释、1 000倍稀释共4个梯度。对上述样品进行beta-actin基因的qPCR检测，获得Ct值，并计算扩增效率和拟合优度(R2)。

2 结果与讨论

2.1 基因克隆

通常来说，基因组拷贝数在同一物种不同组织的体细胞中是相同的，处于有丝分裂S、 G2、 M期、染色体倍性异常的细胞，以及多核细胞等特殊情况除外。因此，通常同等数量的不同组织细胞，其某个基因的拷贝数是一致的，可以通过对基因的定量来测算细胞数。我们选择了GAPDH、beta-actin这两个常见的看家基因作为目标基因，根据其mRNA序列设计了引物(表1)。用红螯螯虾鳃组织的基因组DNA作为模板分别扩增这两个基因的DNA序列，均得到了清晰明亮的单一条带。GAPDH的PCR产物长度约为2 000 bp，beta-actin的PCR产物长度在1 000～2 000 bp之间(图1)。测序结果表明GAPDH基因片段长度为2 066 bp (GenBank登录号: MN918114.1)，beta-actin基因片段长度为1 641 bp(GenBank登录号: MN918115.1)，与琼脂糖凝胶电泳的结果相符。我们将两个基因片段与对应的mRNA序列进行比对，发现两种基因的序列中各含一个内含子，其中GAPDH的内含子长654 bp，beta-actin的内含子长191 bp。

图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 1 Electrophoresis analysis of PCR productsM：分子量标准； a： beta-actin； b： GAPDH。

2.2 qPCR的引物设计和熔解曲线分析

根据获得的GAPDH和beta-actin基因片段设计qPCR引物(表1)，其中一条设计在外显子区，另一条设计在内含子区，使其仅能以基因组DNA为模板进行扩增。其中GAPDH的qPCR产物长100 bp，beta-actin的qPCR产物长56 bp。进一步以多个血细胞和鳃组织的基因组DNA样本为模板，对两个基因qPCR的熔解曲线进行检测，结果表明GAPDH的熔解曲线存在杂峰，说明扩增产物不均一；而beta-actin的熔解曲线呈现出单峰，没有非特异性扩增，效果较好(图2)。因此我们选用beta-actin作为qPCR的目标基因。

2.3 beta-actin基因在不同组织中的扩增效率分析

血细胞是均匀分散的单个细胞，可以采用细胞计数仪进行准确的计数。成熟血细胞不具有分裂能力[21]，基因组DNA不复制，因此其目标基因的含量可以直接与细胞数量对应。所以，本研究选择血细胞作为细胞计数的标准品；以血细胞数目为基准，用qPCR相对标准曲线法测算实体组织的细胞数目。在qPCR中，扩增效率对于实验的准确性至关重要。因此，我们以梯度稀释的鳃、肝胰腺和血细胞的基因组DNA为模板，测算了beta-actin基因的qPCR扩增效率。结果显示，以3种组织的基因组DNA为模板，beta-actin基因的扩增效率均达到qPCR要求的90%～110%范围[22]，扩增效率基本一致(表2)。因此，利用血细胞样品建立的标准曲线能够用于测算其他组织的细胞含量。

2.4 利用qPCR进行实体组织细胞计数

2.4.1 标准曲线的绘制 取3只红螯螯虾，分别抽取约2 mL血淋巴，用细胞计数仪测定血细胞数目，提取基因组DNA。取相当于1×105、1×104、1×103、1×102、1×10个血细胞的DNA样品作为标准模板，进行beta-actin基因的qPCR分析。以血细胞标准品的细胞数对数值和所对应的Ct值作图，绘制标准曲线。结果表明，不同批次样品之间的重复性良好；在测试范围内(1×10～1×105个细胞)，qPCR的Ct值与细胞数的对数之间呈良好的线性关系，线性回归得到回归曲线(图3)和回归方程Ct=38.30-3.37 lg (N)，其中，N是细胞数量。此外，测得R2=0.992，扩增效率为97.74%。

图2 qPCR熔解曲线Fig. 2 qPCR melt curves纵坐标中F为荧光强度，T为温度。

表2 不同组织样品的qPCR扩增效率分析Tab. 2 qPCR amplification efficiency analysis with different tissue samples

图3 qPCR组织细胞计数标准曲线Fig. 3 qPCR standard curve of cell counting

2.4.2 实体组织的细胞计数 取3只螯虾，分别取10 mg鳃组织和肝胰腺组织，提取基因组DNA。随后每个样品取相当于0.2 mg 组织的DNA作为模板进行beta-actin基因的qPCR分析。测得0.2 mg鳃组织样品对应的Ct值为22.65～22.96，根据上述公式计算可得细胞数为3.6×104～4.4×104；0.2 mg肝胰腺组织的Ct值为21.21～21.29，计算可得细胞数为1.1×105～1.2×105。所以鳃组织中平均细胞含量约为2.0×105个细胞/mg，肝胰腺组织中平均细胞含量约为5.8×105个细胞/mg，说明不同组织的细胞含量存在明显差异，相同质量的鳃组织中的细胞数目较少，而肝胰腺组织的细胞数较多。而同一组织不同样本之间的差异较少，鳃组织在1.8×105～2.2×105个细胞/mg之间，肝胰腺组织在5.5×105～6.0×105个细胞/mg之间。上述结果表明qPCR相对标准曲线法能够有效地测算实体组织的细胞数目(表3)。

2.5 讨论

本研究建立了基于基因拷贝数和qPCR的实体组织细胞计数方法。利用这一方法，首先可以定量分析螯虾不同组织在细胞含量上的差异，加深对不同组织结构的认识。其次，在对养殖甲壳动物病毒性疾病的研究中，研究者多以实体组织的整体为单位来评价病毒的组织特异性，比较在不同组织中的增殖效率。而病毒是在宿主细胞中复制繁殖的，同等质量的不同组织细胞含量存在差异。因此以组织质量为单位来衡量病毒在某种细胞中的增殖情况存在一定的不足。通过对特定组织中的病毒量和细胞数的定量分析，可以得出平均每个细胞的病毒载量，能够更准确的了解病毒对不同组织细胞的嗜性。再次，研究者在分析宿主基因表达的时候，也往往以表达量与组织质量的比值作为指标。通过对目标组织进行定量，可以使我们对不同组织基因表达分析的精度提高到细胞水平，提升了组织间基因表达横向比较的维度。此外，研究表明，甲壳动物血细胞数量会受到病原感染、蜕壳周期，昼夜节律等的影响。实体组织中的细胞含量(特别是像鳃这样包含了许多血细胞的实体组织)，是否也有可能会受到上述因素的影响目前尚未可知。本研究所建立的方法为探究这一问题提供了技术手段。

表3 鳃和肝胰腺组织细胞计数结果Tab. 3 Cell count results of gill and hepatopancreas

利用本研究所建立的方法进行细胞计数，需要注意以下几点：①实验中所取的样品量直接影响计数结果，因此每个组织至少需要取3个平行样品以减小取样不均造成的误差。②不同基因组DNA提取试剂盒的提取效率不同，在实验过程中尽量选择同一种试剂盒。此外，在DNA稀释的过程中需尽量准确，避免操作误差。③qPCR过程中，标准样品的扩增效率极为重要，首先要保证待测组织和血细胞标准品的扩增效率相近，才能对待测组织进行测算。如果对于细胞数目的测定精度要求较高，可以考虑增加参考基因数目。除了本实验提供的beta-actin基因，还可设计2～3对其他基因的跨内含子、外显子引物，使用多个基因进行校准。④由于本方法是基于基因拷贝数进行细胞计数，因此对处于有丝分裂期的细胞的测算会存在一定的偏差。如果组织中处于S和M期的细胞比例较高，需要根据比例对细胞数量进行一定的校正。此外，多核细胞无法用本法进行计数。

3 结论

综上所述，本研究建立了基于基因拷贝数和qPCR的螯虾实体组织细胞计数方法。根据螯虾成熟血细胞不能增殖，且其单细胞悬液可以准确计数的特点，选取已知数量的血细胞作为标准样。通过熔解曲线分析，选择了beta-actin基因作为目标基因。利用血细胞基因组DNA为标准模板，进行beta-actin基因的qPCR分析；基于细胞数和Ct值绘制了标准曲线，得出了细胞数量与Ct值的换算公式。并利用相对标准曲线法成功测定了鳃组织和肝胰腺组织的细胞数目。该方法具有简单便捷的优点，可以实现对实体组织细胞数量的高通量测定。