红树林根际土壤中耐高盐苯酚降解菌的分离鉴定

曹宏明，龚 斌，朱丽娟，潘贵妮，刘飞琪，李世盛

(1.广西北部湾海洋灾害研究重点实验室，广西 钦州 535011； 2.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室，广西 钦州 535011； 3.北部湾大学海洋学院，广西 钦州 535011)

苯酚是一种常见的工业原料，对动物具有明显的急慢性毒性[1-4]。在海洋环境中，苯酚广泛存在于海水[5]、沉积物[6]及各种海洋生物体内[7-8]，对海洋生态环境具有潜在的威胁。近10年来，许多研究者分离出上百种能降解苯酚的微生物，并对菌株的降解特性和降解形式做了全面深入的研究[9-14]。国内外已分离和鉴定的苯酚降解菌有芽孢杆菌属(Bacillus)[15]、假单胞菌属(Pseudomonas)[11-12,16-17]、不动杆菌属(Acinetobacter)[18]、无色杆菌属(Achromobacter)[19]等，真菌有镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)[20]、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)等[21]。但是，从海洋环境中分离降解苯酚的微生物的研究还比较少，胡忠等(2007)报道从海洋沉积物中分离、筛选到一株能以苯酚作为唯一碳源和能源的假丝酵母菌(Candidasp.)，其能在较高含量的苯酚条件下生长，在72 h内可以降解苯酚95%以上[22]。Fumihisa等(2012)从海洋动物体内分离的细菌Acinetobactersp. EBR01和Acinetobactersp. EBR02 可以降解海水中的苯酚[23]。Hideshi等(1992)从高盐的样品中分离得到嗜热嗜盐的苯酚降解菌嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)和根瘤菌科的细菌[24]。Sivasubramanian等(2016)从红树林蟹类肠道中分离到的降酚菌包括假单胞菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属(Staphylococcus)[25]。Zhou等(2016)从太平洋的热液喷口中分离到苯酚降解菌嗜酸硫杆菌Sulfobacillusacidophilus，该菌通过Meta通路实现对苯酚的降解[26]。

广西北部湾是我国海洋生态环境保护地最好的区域之一，拥有我国最大面积的红树林保护区和白海豚﹑鲎等珍稀物种。然而近年来，随着临海工业的发展，海洋环境也面临着一定威胁。例如Wang等(2017)报道对35份茅尾海的表层沉积物样品进行20种目标氯化多环芳香烃化合物检测，发现有18种同系物被检出[27]。因此非常有必要从海洋环境中分离高效苯酚降解菌并进行深入研究。本研究从广西北部湾红树林根际土壤中分离出能高效降解苯酚的菌种，并研究其降解特性，可为海洋生态环境修复工程提供一定的理论依据，对海洋生态系统保护、健康化养殖、海岸带养护等都具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 培养基和试剂

LB培养液：胰蛋白胨10 g、酵母粉10 g、NaCl 5 g，蒸馏水定容至1 L。无机盐培养基：NH4NO31.0 g、 CaCl20.1 g、 K2HPO40.5 g、 KH2PO40.5 g、NaCl 10 g、MgSO40.25 g、海水晶15 g, 蒸馏水定容至1 L。高盐(70 g/L NaCl)无机盐培养基：前述无机盐培养基中NaCl增加至55 g即可。

1.2 细菌的富集和分离

本实验所用菌株采自山口红树林国家级自然保护区﹑北海金海湾红树林、广西茅尾海红树林自然保护区的红树林根际土壤。各取20 g采集的土壤样本加入100 mL苯酚含量为400 mg/L 的高盐无机盐培养基中，放入恒温振荡培养箱中，培养条件为28 ℃、150 r/min，培养7 d。移取培养液1 mL加入装有100 mL高盐无机盐培养基的锥形瓶中，加入苯酚作为唯一碳源，连续转接富集培养4次，苯酚梯度依次递增为800、1 200、1 500、2 000 mg/L，最后取各梯度富集培养液涂布到500 mg/L苯酚为碳源的无机盐培养基平板上，28 ℃培养5 d后挑取形态上有差异的单菌落在含量为500 mg/L苯酚为碳源的无机盐培养基平板上划线分离培养，得到纯种的菌株, 再测定其苯酚降解特性。

1.3 菌体生物量和苯酚含量的测定

取5 mL培养液于12 000 r/min下离心10 min后, 用空白无机盐培养基作为参比，沉淀以等量蒸馏水悬浮后测定其OD600值, 用来表示菌体生物量；上清液用于苯酚含量的测定, 采用4-氨基安替比林法进行[28]。

1.4 菌株的鉴定

菌株的生理生化特性鉴定参照文献[29]进行, 菌株16S rRNA基因序列的扩增、测定和同源性比较参照文献进行[30]。

1.4.1 降解菌株的16S rRNA与gyrBPCR扩增与测序 选取降解率高、生长速度快的不同种属的菌株进行基因扩增，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(Phygene)方法提取菌株DNA，以基因组DNA作为模板，进行菌株的16S rRNA和gyrBPCR扩增，16S rRNA基因扩增引物参考文献[31]，gyrB基因扩增引物参考文献[32]。反应体系(50 μL)：2×Taq MasterMix 25 μL，细菌通用引物4 μL，模板1 μL，超纯水20 μL；反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。扩增产物送去南京金斯瑞生物科技有限公司测序，16S rRNA序列用EzBioCloud数据库进行同源性比较，gyrB序列在GenBank数据库中用NCBI-BLAST软件进行同源性比较。取同源性较高的序列，用Mega 5.0软件构建系统发育树。

1.4.2 菌株DNA BOX-PCR遗传多样性分析 本研究BOX-PCR引物参考文献[33]。10 μL反应体系：2×Taq MasterMix 5 μL，引物2 μL，模板1 μL，超纯水2 μL。BOX-PCR 反应程序：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，30个循环；65 ℃延伸18 min，12 ℃保存。

1.5 苯酚降解菌的降解特性

1.5.1 苯酚降解曲线 取在20%甘油中保藏的苯酚降解菌种100 μL接入5 mL的LB培养液中过夜活化，然后转接1 mL菌液加入苯酚含量为1 000 mg/L的无机盐培养基中，放入28 ℃、150 r/min的摇床中培养。分时段取样测定苯酚降解率及菌体OD600值。

1.5.2 环境因素影响 分别研究温度(20、25、30、35、40 ℃)、pH(2、4、6、8、10)、NaCl含量(20、40、60、80、100 g/L)对菌株苯酚降解率的影响。

1.5.3 降解谱的测定 分别向以含量为200 mg/L的邻苯二酚、对苯二酚、蒽、萘、甲苯、二甲苯、苯甲酸钠、邻二氯苯和间苯二酚为唯一碳源的无机盐培养基中，按1∶50(V/V)接入活化的降解菌，于28 ℃、150 r/min的摇床中培养。用紫外分光光度计在200 nm波长下测定培养上清液中上述芳香化合物的含量，结合细菌的生长情况，判断苯酚降解菌的降解谱。

2 结果与讨论

2.1 红树林根际土壤中苯酚降解菌的分离

经对山口红树林国家级自然保护区﹑北海金海湾红树林﹑茅尾海红树林自然保护区的红树林根际土壤分别富集培养，得到苯酚降解菌30株。从山口红树林国家级自然保护区根际土壤中纯化了16株，其中耐高盐(70 g/L NaCl)环境降解菌有11株；从北海金海湾红树林自然保护区根际土壤中纯化了11株，耐高盐(70 g/L NaCl)环境有6株；从茅尾海红树林自然保护区土壤中纯化了3株，都不能耐高盐(70 g/L NaCl)环境。经过BOX-PCR实验证明，这30株菌株具有相似的电泳多态性特征。30株菌株的苯酚降解率如表1所示，当苯酚含量为1 000 mg/L时，有5株苯酚降解菌在48 h后降解率达80%以上，降解苯酚的效率比较高。这5株菌株都能耐受70 g/L NaCl的高盐环境，其中3株来自山口红树林国家级自然保护区，有2株来自北海金海湾红树林自然保护区，编号分别是FGYS1、FGYS7、FGYS11、FGYB1和FGYB5。

表1 红树林根际土壤中苯酚降解菌的降解率Tab. 1 Degrading rate of phenol-degrading bacteria from rhizosphere soil of mangrove

2.2 高效苯酚降解菌株的鉴定

经过鉴定分离到的5株苯酚降解菌菌落光滑，革兰氏染色为阴性，呈杆状，能运动，不能发酵葡萄糖。提取菌株FGYS1、FGYS7、FGYS11、FGYB1和FGYB5的总DNA，进行16S rRNA基因扩增。通过Clustal W软件多序列比对分析表明，来自山口红树林国家级自然保护区的菌株FGYS1、FGYS7和FGYS11的16S rRNA序列完全相同，而来自北海金海湾红树林自然保护区的菌株FGYB1和FGYB5 16S rRNA序列完全相同，而以上两组序列仅在3个位点存在差异。

将菌株的序列与EzBioCloud数据库中的细菌16S rRNA序列进行相似性比较，5株苯酚降解菌均属于假单胞菌属。菌株FGYS1、FGYS7和FGYS11与假单胞菌Pseudomonasextremaustralis14-3T和PseudomonasmeridianaCMS 38T的16S rRNA序列相似性分别达到99.71%和99.64%。菌株FGYB1和FGYB5与假单胞菌PseudomonasveroniiDSM 11331T和Pseudomonasextremaustralis14-3T的16S rRNA序列相似性均达到99.64%。通过16S rRNA序列的系统发育树分析，结果表明菌株FGYS1、FGYS7、FGYS11、FGYB1和FGYB5在进化上与P.veronii为同一个分支(图1)。

图1 苯酚降解菌16S rRNA序列系统发育树Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of the phenol-degrading bacteria

经检测菌株FGYS1与假单胞菌PseudomonasextremaustralisDSM 17835T的gyrB序列相似度最高，为92%。通过对菌株FGYS1与GenBank数据库中其他gyrB序列的比对分析，我们构建了基于gyrB序列相似性的系统发育树，结果表明菌株FGYS1与假单胞菌PseudomonasextremaustralisDSM 17835T在同一个分支(图2)。

2.3 苯酚降解特性

2.3.1 苯酚降解菌的降解能力 菌株FGYS1 可3 d后完全降解1 500 mg/L苯酚，菌株FGYB1可5 d后完全降解1 500 mg/L苯酚。以含量为1 000 mg/L的苯酚作为唯一碳源，菌株FGYS1和FGYB1在40 h时将苯酚完全降解(图3)。两株菌株的生长速度和其对苯酚的降解率均呈线性增长，菌株FGYS1在30 h时苯酚的降解率达到79%，菌株FGYB1在30 h时苯酚的降解率为63%，菌株FGYS1的降解速度快于菌株FGYB1。

2.3.2 环境因素对菌株苯酚降解率的影响 微生物的生长和降解特性对环境条件的变化较为敏感，本研究探讨了温度、盐度和pH等因素对菌株FGYS1和FGYB1生长速度及降解苯酚性能的影响。如图4(a)所示，菌株FGYS1在20～30 ℃时，其菌体生长速度和对苯酚的降解率均随温度的升高而增大，在30～35 ℃时对苯酚的降解率和生长速度达到最大；当苯酚的初始含量为500 mg/L时在24 h时将苯酚完全降解，而高于35 ℃时随温度的上升苯酚的降解率明显降低；如图4(b)所示，菌株FGYB1在20～25 ℃时菌体生长速度和对苯酚的降解率随温度升高而增大，在25～30 ℃时对苯酚的降解率和生长速度达到最大；当苯酚的初始含量为500 mg/L时在24 h将苯酚完全降解，而高于30 ℃时随温度的上升苯酚的降解率明显降低。

图2 苯酚降解菌gyrB序列系统发育树Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of gyrB gene sequence of the phenol-degrading bacteria

图3 苯酚降解菌生长曲线及其对苯酚的降解率Fig. 3 Growth curves and phenol degradation by strains FGYS1 and FGYB1

pH对苯酚降解率影响的实验结果(图5)表明，当溶液中苯酚含量为1 000 mg/L时，菌株FGYS1在初始 pH为2～4时生长速度和对苯酚的降解率随 pH的增大而升高，在pH为4 时苯酚降解率达到最高(66%)，此时菌体生物量也达最大(OD600值为0.779)，最适pH为4。当pH大于4时，随着 pH的增大，菌株FGYS1的生长速度和对苯酚的降解率呈下降之势。菌株FGYB1在初始 pH为2～4时菌体生长速度和对苯酚的降解率随 pH的增大而升高，在pH为4时达到最高，随后菌体生长速度和苯酚降解率随 pH 值的增大而降低。以上结果说明，两株菌株在酸性条件下生长情况和降酚能力较好，在偏碱性条件下生长缓慢且苯酚降解率下降。

菌株FGYS1在NaCl含量为20～40 g/L时菌株降解苯酚效果好[图6(a)]，24 h后对含量为500 mg/L的苯酚降解率可达100%；在NaCl含量大于40 g/L时，菌株的生长速度和对苯酚的降解率开始受到抑制。经培养72 h后，苯酚在NaCl含量为60 g/L的条件下可被完全降解，在NaCl含量为80 g/L 时5 d后可被完全降解，在NaCl含量为100 g/L的情况下菌株生长速度和降解率都受到严重抑制。菌株FGYB1的生长速度和对苯酚的降解率随NaCl含量的增大而下降[6(b)]，但在NaCl含量为100 g/L时培养4 d后500 mg/L苯酚也能被完全降解。说明高盐度影响降解菌的生长速度和对苯酚的降解率，NaCl含量大于40 g/L时明显延缓了苯酚的降解速度，但两株菌株都有很强的耐高盐能力。

图4 温度对苯酚降解菌的降解率与生长的影响Fig. 4 Effects of temperature on phenol degradation and growth by strains FGYS1 and FGYB1

图5 pH对苯酚降解菌的降解率与生长的影响Fig. 5 Effects of pH value on phenol degradation and growth by strains FGYS1 and FGYB1

图6 NaCl含量对苯酚降解菌的降解率与生长的影响Fig. 6 Effects of sodium chloride concentration on phenol degradation and growth by strains FGYS1 and FGYB1

2.3.3 苯酚降解菌的降解谱 研究表明，苯酚降解菌FGYS1和FGYB1的降解谱相同。在有机物含量为200 mg/L时，菌株FGYS1和FGYB1能够分别在以邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚为唯一碳源的液体无机盐培养基中生长，并将有机物完全降解。其他被检测的有机物如蒽、萘、甲苯、二甲苯、苯甲酸钠和邻二氯苯不能被降解。

2.4 讨论

随着我国经济发展，很多沿海城市布局了芳香烃类企业。广西北部湾原本是我国近海海洋环境最好的地区之一，近年来也在钦州港布局了多个芳香烃化工企业，这给环境造成了很大压力。从海洋环境中分离获得高效芳烃降解菌，不仅对海洋微生物资源的利用具有重要意义，也为海洋生态修复和保护奠定了很好的基础。研究表明，向苯酚污染的环境中引入苯酚降解菌，有利于环境的改善。例如，Ibáez等(2014)报道，向环境中引入一种降酚的芽孢杆菌后，可以明显促进苯酚污染的环境中箭筈豌豆(Viciasativa)根的伸长率和发芽指数，并且可以加速去除土壤中的酚污染[34]；Cordova-Rosa等(2009)研究表明，向活性污泥中引入一种苯酚降解菌(Acinetobactercalcoaceticus, 最高可降解苯酚含量为1 200 mg/L)，可以明显强化活性污泥的苯酚降解能力，经过20 d的生物强化，污泥-土壤基质的残留苯酚含量为1.13 mg/kg[35]。本研究从广西北部湾红树林根际土壤中分离的高效苯酚降解菌，不仅降酚能力非常强(最高可降解含量为1 500 mg/L的苯酚)，而且具有能够适应本土红树林环境的优点，还兼具耐高盐、耐酸和同时降解多种芳香化合物的特性，在应对将来红树林芳烃污染和生态环境修复方面显示了较大的潜力。

目前发现和研究比较多的假单胞菌属苯酚降解菌有Pseudomonasfluorescence[36]、Pseudomonasaeruginosa[37]、Pseudomonasputida[38]和Pseudomonaspseudoalcaligenes[39]等菌株，还有其他未被鉴定到种的假单胞菌属苯酚降解菌[40-41]。本研究从红树林根际土壤中发现的苯酚降解率最高的菌株FGYS1通过16S rRNA和gyrB序列比对分析，进化关系上与P.extremaustralis和P.veronii关系较近。Tribelli等(2018)的研究表明，P.extremaustralis具有降解烷烃的能力[42]；另有研究发现P.extremaustralis具有很强的极端环境适应能力[43]。P.veronii曾被发现具有降解甲苯[44]和苯[45]的能力。但是P.extremaustralis和P.veronii目前均没有报道可以降解苯酚。

本研究从北部湾3个不同的红树林区根际土壤中最终筛选得到的5株耐高盐的高效苯酚降解菌，其16S rRNA序列非常接近，来自山口红树林国家级自然保护区的菌株FGYS1、FGYS7和FGYS11的16S rRNA序列完全相同，而来自北海金海湾红树林自然保护区的菌株FGYB1和FGYB5的16S rRNA序列完全相同，而以上两组序列仅在3个位点存在差异，这印证了Rutger等(2006)提出的微生物全球分布的假说(即Baas Becking假说)，该假说认为不同环境中微生物的差异是由环境决定的[46]。本研究中，可能苯酚降解菌的类型特征在不同红树林生境中是随机分布的，所以我们从北部湾几个不同红树林区根际土壤中得到的耐高盐的高效苯酚降解菌的分类地位是相同的，只是由于不同的红树林环境的选择作用，导致不同生境中的苯酚降解菌会向不同的遗传方向突变和进化。

3 结论

(1)从北部湾红树林根际土壤中筛选到5株耐高盐的高效苯酚降解菌，为假单胞菌属，最高可降解含量为1 500 mg/L的苯酚。菌株FGYS1和FGYB1可分别3 d和5 d后完全降解1 500 mg/L苯酚。

(2)菌株 FGYS1 降解苯酚的适宜温度为25～35 ℃、适宜pH为4～6、最高耐NaCl含量为60 g/L。菌株 FGYB1 降解苯酚的适宜温度为25～35 ℃、适宜pH为4～6、最高耐NaCl含量为100 g/L。菌株FGYS1和FGYB1对pH、温度和盐度的适应范围较广，具有应用于苯酚污染的生态环境修复的潜力。

(3)菌株FGYS1和FGYB1能够分别在以邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚为唯一碳源的液体无机盐培养基中生长。