中国沿海贪食共生藻的形态、超微结构和分子特征

张薇，罗肇河，高越，顾海峰*

(1.自然资源部第三海洋研究所，福建 厦门 361005； 2.厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室，福建 厦门 361005)

共生藻属(Symbiodinium)主要指一类与无脊椎动物或原生生物共生的甲藻，是热带和亚热带海洋生态系统常见物种[1-2]。其中最常见的是与珊瑚共生的种类，与珊瑚的共生关系是维持珊瑚存活和生长的关键，因此得以被广泛而深入的研究[3-4]。Freudenthal (1962)首次描述了共生藻属，并且认为所有共生的甲藻都是微小亚德里共生藻(Symbiodiniummicroadriaticum)[5]，但是后来的研究表明甲藻许多物种的生活史都涉及共生阶段，例如：前沟藻属(Amphidinium)、原甲藻属(Prorocentrum)、梨甲藻属(Pyrocystis)、斯克里普藻属(Scrippsiella)、黏球藻属(Gloeodinium)和单沟藻属(Pelagodinium)的部分物种[6-9]。共生藻属最早因为其生活史共生阶段的细胞呈球形被划分到共生藻科[10]，后来Moestrup等(2009)依据其模式种微小亚德里共生藻和最近报道的自在共生藻(Symbiodiniumnatans)具有E型眼点(Type EsensuMoestrup & Daugbjerg, 2007：由一系列砖墙状排列具有膜结构的水晶泡组成且位于叶绿体体外部)和单线长甲板型顶沟复合体(Elongate Apical Vesicle, EAV)建议将其划归到修斯藻科[11]。

由于大部分共生藻属物种不易体外培养或者因为与无脊椎动物或原生生物长期共生使得其本身形态特征并不显著或者容易变形，很难运用传统的形态学来定义和描述它们[12-14]。基于核糖体大亚基(Large Subunit Ribosomal DNA, LSU rDNA)和叶绿体核糖体(Chloroplast Ribosomal DNA, cp23S)序列的系统发育研究形成了普遍认可的以系群(Clade)为阶元的共生藻属进化遗传学分类系统[12,15-16]。共生藻属目前包含A-I共9个系群，每个系群基于转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)系统发育又可细分为多个亚系群[17]。LaJeunesse等(2012)基于综合的进化遗传学证据定义了两个新的共生藻：微小共生藻(Symbiodiniumminutum)和嗜冷共生藻(Symbiodiniumpsygmophilum)，并且建议推广进化遗传学分类系统作为未来定义新共生藻属物种的方法[13]。进化遗传学分类方法虽然解决了共生藻属部分分类学问题，但依然没有形成一个公认的物种命名系统。目前仅微小亚德里共生藻、自在共生藻和贪食共生藻具有形态和超微结构描述，而多毛共生藻(Symbiodiniumpilosum)、川口共生藻(Symbiodiniumkawagutii)、戈罗共生藻(Symbiodiniumgoreauii)和林奇共生藻(Symbiodiniumlinucheae)仅具有超微结构描述，另外还有8个种(Symbiodiniumbermudense、Symbiodiniumcariborum、Symbiodiniumcorculorum、Symbiodiniummeandrinae、Symbiodiniummuscatinei、Symbiodiniumpulchrorum、Symbiodiniumglynnii和Symbiodiniumtrenchi)没有形态学描述[8,18-20]。

贪食共生藻是一种既可以和珊瑚共生又可以自由生活的共生藻，在西北、西南和东北温带太平洋地区以及地中海均有报道[21-22]，但直到最近才被正式命名[23]。Jeong等(2014)收集了来自世界各地的共生和自由生活的系群E共生藻株系，基于形态学和分子生物学方法证明了它们属于同一个种——贪食共生藻[23]。研究表明来自世界各地的贪食共生藻株系的核糖体基因(LSU rDNA，ITS和SSU rDNA)、cp23S和线粒体细胞色素b基因(Mitochondrial Cytochromeb,cob)序列高度一致[23]。这些来自细胞内不同位置(细胞核、叶绿体和线粒体)的基因常被用于共生藻属物种多样性和生态学研究的标记基因，它们的一致说明不同地理种群的贪食共生藻之间存在不间断的基因交流或者它们具有共同的起源直到近代才因为自然或者人为因素分散到世界各地，但是目前还没有直接的证据来证明这些推断。基于SSU rDNA序列的系统发育结果，一株分离自胶州湾的Symbiodiniumsp. (株系G15)首次被鉴定为“自由生活”的共生藻[24]。后来的研究推测其也是贪食共生藻[23]，但是目前还没有相应的形态和超微结构证据。我们从中国沿海以及一艘停靠在厦门港的货轮压舱水的底部沉积物中分离出了4株贪食共生藻，运用光镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜对它们的形态和超微结构进行了细致的研究，并且结合核糖体基因、cp23S和cob序列差异和(或)系统发育来讨论世界各地贪食共生藻的遗传进化和人类活动的辅助传播。

1 材料与方法

1.1 样品采集和培养

株系SCXM82分离自厦门港表层海水。采集到的海水经100 μm筛绢过滤并且收集滤过液(小于100 μm)。在奥林帕斯BX51显微镜(Olympus, Tokyo)下寻找并挑取单个甲藻细胞到预装有f/2-Si海水培养基[25]的96孔细胞培养板。样品在20 ℃、90 μmol/( m2· s)光照和12 h∶12 h光暗循环(标准培养条件)下培养富集。株系GLN和株系SymND由厦门大学海洋微型生物保种中心(CCMA)提供，并且在f/2-Si培养基和标准条件下培养。株系XING分离自一艘停靠在厦门港货轮压舱水的底部沉积物中的不动细胞，并且在 f/2-Si培养基和标准条件下培养。样品具体采集时间地点见表1。

表1 贪食共生藻株系、采集地点和时间Tab. 1 Strains of Symbiodinium voratum, sites and time of collection

1.2 光镜观察

利用装备有微分干涉光源(DIC)和Axiocam HRc数码相机的蔡司显微镜(Carl Zeiss, Göttingen, Germany)观察并拍摄贪食共生藻的不动细胞、对数生长期的运动细胞和二分裂状态的细胞(Doublet Cell)。运用蔡司软件系统(Axiovision Software V 4.8.2)在拍摄到的高分辨率图上对细胞进行大小测量，株系GLN和XING分别量取50个细胞。

1.3 扫描电子显微镜观察

取1 mL对数生长期细胞与无菌海水配制的锇酸(2 %，体积占比，下同)等体积混合在20 ℃下避光隔夜固定。将自然沉降下来的细胞滴加到涂有左旋多聚赖氨酸(分子量70 000～150 000, Sigma)的盖玻片上，静置30 min以便细胞粘附在盖玻片上。样品先后经过无菌海水、50 %无菌海水和Mill-Q水各浸泡10 min除去盐分，然后乙醇梯度脱水(10%、30%、50%、70%、90%和3次100 %，每次10 min)。样品经过K850临界点干燥仪(Quorum/Emitech, West Sussex)干燥、喷金，最后在LEO1 530扫描电子显微镜(Zeiss/LEO, Oberkochen)下观察拍照。

1.4 透射电子显微镜观察

取戊二醛(Ted Pella, Redding, CA)缓慢加入到20 mL对数生长期藻液中(终浓度2.5%)，20 ℃固定3 h。离心(4 000 r/min，10 min)收集细胞并用无菌海水洗涤3次，每次10 min，然后加入1%无菌海水配制的锇酸在4 ℃避光隔夜固定。离心(4 000 r/min，3 min)收集细胞并且用无菌海水洗涤3次，每次10 min。样品经乙醇梯度脱水(10%、30%、50%、70%、90% 和 3次 100%，每次10 min)，然后用Spurr包埋剂包埋[26]。包埋块经EM UC7超薄切片机(Leica, Vienna)切片，然后乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，最后在JEOL JEM-1400透射电子显微镜(JEOL, Tokyo)下观察拍照。

1.5 DNA提取、序列扩增和测序

取大约20 mL对数生长期藻液室温下离心(13 400 r/min， 10 min)收集细胞。用MiniBEST Universal DNA Extraction Kit (Takara, Tokyo)试剂盒按其说明书步骤提取样品总DNA。LSU rDNA (D1-D6区)序列扩增引物为D1R[27]和28-1483R[28]。SSU rDNA序列扩增用真核生物通用引物Primer A和Primer B[29]。50 μL聚合酶链反应(PCR)体系：1×PCR缓冲液，4种脱氧核糖核酸各0.2 mmol/L，正反方向引物各0.2 μmol/L，10 ng模板DNA和1 U的ExTaq DNA聚合酶(Takara, Tokyo)。PCR反应程序：94 ℃预变性10 min；然后30个循环扩增，每个循环包括94 ℃变性1 min，45 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃延伸10 min。ITS (ITS1-5.8S-ITS2)序列扩增引物为ITSA和ITSB[30]。除了退火温度改为50 ℃外，PCR反应体系和程序和前述LSU rDNA序列扩增方案相同。cp23S和cob序列分别按照Santos等(2002)和Zhang等(2005)提供的引物和反应程序进行扩增[31-32]。以上PCR产物经过纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司，利用ABI PRISM 3730XL测序仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)双向直接测序。

1.6 序列处理和系统发育分析

中国沿海贪食共生藻的LSU rDNA序列和基因库(Genbank)上下载的其他共生藻的序列首先经过MAFFT V7.110[33]在线系统在L-INS-I方案[34]下进行比对，然后用BioEdit V7.0.5人工切除头尾多余的序列[35]。对于贝叶斯(Bayesian Inference, BI)系统发育，我们首先采用jModelTest 2 V2.1.4[36]在Akaike信息准则(AIC)下选择最优进化模型，然后运用MrBayes 3.2[37]和选出的最优模型(TIM3+I+G)来构建系统发育树。4条马尔可夫链蒙特卡尔分析(MCMC，3条热链 1条冷链)同时运行1×106代，每100代取样一次。马尔可夫链蒙特卡尔的收敛利用AWTY在线工具的累积函数来作图形化的评估[38]，并且分析每个分支的后验概率(Posterior Probability,PP)值。最大似然法(Maximum Likelihood, ML)系统发育树利用T-REX网站[39]上的RaxML V7.2.6[40]进行构建，并运行1 000次自展分析来衡量分支的节点支持率。

ITS和基因库(Genbank)上下载的其他地区的贪食共生藻序列同样经过MAFFT V7.110[33]在线系统比对，然后运用PAUP*4b10软件[41]来计算不同地理株系间的遗传距离(未校正P距离)。SSU rDNA、 cp23S和cob序列和基因库上下载的其他地区贪食共生藻的对应序列用DNAman (Version 6.0, Lynnon Biosoft)进行比对并且计算相似度。

2 结果与讨论

2.1 形态和超微结构

贪食共生藻SymbiodiniumvoratumJeong, Lee, Kang & LaJeunesse的形态和超微结构见图 1～4。

3株贪食共生藻(SCXM82，GLN，GymND)分离自中国沿海水体，1株(XING)采集自一艘停靠在厦门港的货轮压舱水的底部沉积物(表1)。株系XING的运动细胞长9.7±1.3 μm，宽8.7±0.9 μm (n=50)；球形不动细胞直径11.4±0.3 μm；近球形二分裂细胞直径12.2±0.6 μm。运动细胞上鞘略大于下鞘，鞭毛长大约是细胞长的1.5倍[图1(a)]。细胞核大且呈球形位于上鞘，有一个淀粉核位于细胞核下方[图1(b)、(c)]。眼点位于腹面纵沟位置[图1(c)]。细胞常在一个很小范围内旋转，几个月甚至半年不更新培养基都可存活。在培养液底部常见许多不动细胞[图1(d)]和二分裂细胞[图1(e)]，且它们都有一个明亮的红色体，培养条件下未见四分裂和八分裂细胞。

在扫描电子显微镜下对株系XING、GLN和GymND进行观察和拍照，它们均显示出相似的甲板排列。运动细胞上鞘呈球形，下鞘从背腹面看略微不对称[图2(a)、(b)]。一个单线长甲板型顶沟复合体位于细胞顶部[图2(c)至(g)]，顶沟复合体中心有大约13个球形突起(Knob)[图2(c)、(d)]。一块方形的小板(X板)位于顶沟复合体的腹面[图2(c)至(g)]。运动细胞具有5块顶板(Apical Plate)，一些细胞(大约16%)的甲板2′和3′可能融合成一块[图2(f)、(g)]。细胞具有9块沟前板(Precingular Plate)和6块前间插板(Anterior Intercalary Plate)[图2(a)、(b)、(c)、(g)]。甲板3a、4a和5a 可变，极少量细胞(大约1 %)的甲板4a和5a合并成一块，而3a则可能分裂成两块(未列出)。横沟(Cingulum)和纵沟都很宽[图2(a)]。横沟位于细胞中部，由两排五边形甲板组成，下旋大约一个横沟宽度[图2(a)、(i)]。鞭毛孔位于纵沟位置，鞭毛孔之间有一个捕食茎(Peduncle)[图2(h)]。下鞘由6块沟后板(Postcingular Plate)和2块底板(Antapical Plate)组成[图2(j)至(l)]。2块纵沟板(sp和s)清晰可见，另外还有一块(s？)仅露出了一部分[图2(l)]。图3画出了中国沿海贪食共生藻典型的甲板排列示意图。

图1 贪食共生藻(株系XING)光镜图片Fig. 1 Light micrographs of Symbiodinium voratum (strain XING)(a)：运动细胞腹面观，示纵沟鞭毛(箭头)；(b)：运动细胞背面观，示椭圆形细胞核(N)和单茎的淀粉核(Py)；(c)：细胞侧面观，示眼点(箭头)和淀粉核(Py)；(d)：不动细胞，示红色体(箭头)；(e)：二分裂细胞，示红色体(箭头)。

图2 贪食共生藻(株系XING)运动细胞扫描电子显微镜图片Fig. 2 Scanning electron micrographs of Symbiodinium voratum motile cells (strain XING)(a)：腹面观；(b)：背面观；(c)：顶面观，示EAV型顶沟(箭头)；(d)至(f)：顶面观，示EAV型顶沟和其周围的板块；(g)：顶面观，示X板、顶板和间插板；(h)：腹面观，示捕食茎(箭头)；(i)：背面观，示横沟板；(j)、(k)：底面观，示底板和沟后板；(l)：底面观，示纵沟板。

在透射电子显微镜下对株系XING和GLN进行观察和拍照，它们均显示出相似的超微结构。横切面和纵切面显示有许多形状不规则的叶绿体分布在细胞周围[图4(a)至(c)]。细胞核位于细胞上鞘，内含许多染色体；油滴和线粒体随机散落于细胞内部[图4(a)、(b)]。1个外包淀粉鞘的单茎大淀粉核(Pyrenoid)位于细胞中上部[图4(a)、(c)]。周质膜由一层外膜和内部的一系列甲板组成；位于细胞顶端的球形突起清晰可见[图4(d)]。眼点在叶绿体外部位于纵沟，由一系列砖墙状排列具有膜结构的水晶泡组成[图4(e)]。高尔基体由许多平行排列扁平的囊泡组成，两侧有许多运输囊泡[图4(f)]。叶绿体内含平行排列的3层膜组成的类囊体 [图4(g)]。

2.2 分子特征和系统发育

本研究分离到的4株贪食共生藻的核糖体基因(SSU rDNA、 ITS和LSU rDNA)、 cp23S和cob序列完全一致。对于LSU rDNA，它们和胶州湾(株系G15, AY160123部分序列)、地中海(株系RCC1521, KF364606)的贪食共生藻序列相同，但和韩国(株系SvFL 1, HF568830)、英国(株系CCMP421, AY684264)以及美国(株系rt-383, KF364605)的贪食共生藻序列分别有1 bp、1 bp以及2 bp的差异。基于LSU rDNA序列由最大似然法和贝叶斯方法构建的系统发育树显示出相似的分支结构(图5)。中国沿海和世界其他地方的贪食共生藻很好的聚类在一起组成系群E，自展分析支持率和后验概率值都达到了最大值(分别为100 %和1.00)。但是该种和其他类群的距离较远，表明该种为一个完全分化的物种。对于ITS(580 bp)，它们和胶州湾(株系G15，AY160123)、韩国(株系SvFL 1，HF568830)、英国(株系CCMP421，EU074907)、日本(株系RIKEN，AB546599)以及美国(株系rt-383，AF334659)的贪食共生藻分别有1 bp(相似度99.82 %)、3 bp(相似度99.47 %)、3 bp(相似度99.47 %)、4 bp(相似度99.29 %)以及5 bp(相似度99.12 %) 的差异。世界各地贪食共生藻株系间基于ITS序列的遗传距离(未校正P距离)为0.001 7～0.008 7(表2)。对于SSU rDNA(序列长度1 752 bp)，它们和胶州湾(株系G15，AY160123)、韩国(株系SvFL 1，HF568830)、英国(株系CCMP421，AF274279)以及美国(株系rt-383，AF225965)的贪食共生藻都有2 bp(相似度99.89%)的差异，而对于cp23S和cob，它们和世界各地的贪食共生藻序列完全相同。中国株系和其他地方贪食共生藻的遗传分化很小，显示它们之间有频繁的基因交流。

图3 贪食共生藻典型的甲板排列示意图Fig. 3 Line drawing of the most common pattern thecal plates of Symbiodinium voratum

图4 贪食共生藻(株系XING)运动细胞透射电子显微镜图片Fig. 4 Transmission electron micrographs of Symbiodinium voratum motile cells (strain XING)(a)：纵切面，示细胞核(N)、叶绿体(chl)、淀粉核(Py)、线粒体(mt)和油滴(L)；(b)：横切面，示细胞核(N)和环绕的叶绿体(chl)；(c)：横切面，示单茎的淀粉核(Py)；(d)：纵切面，示甲板(t)、甲板间隙(s)、外膜(om)和顶部的球形突起(k)；(e)：E型眼点；(f)：高尔基体和两侧的运输囊泡(箭头)；(g)：叶绿体及其三层膜组成的类囊体(箭头)。

图5 基于核糖体大亚基(LSU rRNA， D1-D2区)序列由最大似然法构建的共生藻属系统发育树Fig. 5 Phylogeny of Symbiodinium inferred from LSU rDNA (D1-D2 region) sequence based on maximum likelihood (ML)单沟藻 (Pelagodinium béii)选为外源类群；节点的数字是最大似然法的自展分析支持度(左)和贝叶斯的后验概率(右)；自展分析支持度小于50或者后验概率小于0.5的以“-”代替。

表2 基于转录间隔区序列(580 bp)的贪食共生藻不同地理株系间的遗传距离(未校正P距离)Tab. 2 Estimated uncorrected genetic distances (P values) between different geographic Symbiodinium voratum strainson the basis of ITS region sequences (580 bp)

2.3 讨论

2.3.1 形态和超微结构特征 目前只有微小亚德里共生藻、自在共生藻和贪食共生藻的甲板结构被描述[23,42-43]。中国沿海采集到的共生藻株系的甲板方程为： x, EAV, 4′-5′, 5a-6a, 9′′, ?s, ?c, 6′′′, 2′′′′，基本符合贪食共生藻的最初描述。然而Jeong等(2014)报道称英国的贪食共生藻(株系CCMP 421)顶板为5～7块、沟前板为8块[23]，而中国沿海株系的顶板为4～5块，沟前板为9块，这可能是不同地理株系的贪食共生藻甲板具有可变性。实际上不仅上鞘，韩国贪食共生藻(株系SvFL 1)下鞘的沟后板是6块或7块，而底板也在2块和3块之间变化[23]。甲板可变的情况也同样出现在微小亚德里共生藻和自在共生藻[42-43]，说明共生藻属物种甲板结构在一定的范围内具有可变的通性，这给共生藻属的分类学研究增加了困难。

超微结构显示英国 (株系CCMP 421)和韩国贪食共生藻(株系SvFL 1)的淀粉核都具有2个茎[23]，而中国沿海株系的淀粉核都只有1个茎。目前除了戈罗共生藻的淀粉核具有3个茎外，其他已报到的共生藻属物种(微小亚德里共生藻、自在共生藻、林奇共生藻、川口共生藻和多毛共生藻)的淀粉核都是2个茎[2,42-44]。淀粉核的茎数目变化是由于地理种群间的差异，还是存在亚种水平的差别，需要更多的株系和实验来阐明。以往的研究很少涉及共生藻属物种的高尔基体形态，仅Blank(1987)通过冷冻电镜三维重构技术展示了一株分离自疣表孔珊瑚(Montiporaverrucosa)的共生藻不动细胞的高尔基体[45]，我们首次报道了贪食共生藻运动细胞中由许多平行排列扁平囊泡组成的高尔基体形态。贪食共生藻运动细胞中高尔基体两侧的运输小泡比前者多[45]，说明贪食共生藻运动细胞的高尔基体代谢活动显著高于疣表孔珊瑚共生藻的不动细胞。

2.3.2 兼性营养特性 研究表明许多共生藻属物种具有捕食茎[2,23,42-43]，共生藻物种的兼性营养能力极大的增强了它们在时常处于低营养盐的珊瑚礁环境下存活和繁殖的能力[46]。室内培养条件下显示中国沿海贪食共生藻株系生命力顽强，几个月甚至半年不更新培养基都可良好存活，兼性营养能力可能是重要的原因。Jeong等(2012)通过实验证明了贪食共生藻能够通过捕食茎摄食细菌、蓝藻和小型藻类，并且观察记录到了它能够摄食掉珊瑚礁地区很大一部分的聚球藻(Synechococcus)[46]。另外，Shao等(2004)从珠江口附近的一次赤潮水体中分离出了贪食共生藻[47]，说明其可能在某些物种赤潮的消亡过程中扮演非常重要的角色。

2.3.3 分子特征与传播的关系 自15世纪大航海时代以来，船运极大地促进了世界经济、科技、文化的交流，缩短了世界各地的时空距离。日益发达的船运线路使得包括甲藻在内的许多生物通过水产进出口或者压舱水被带往世界各地，极大的拓展了它们的地理分布[48-50]。基于LSU rDNA序列的系统发育显示世界各地贪食共生藻很好的聚类在一起，而且它们ITS序列遗传距离也显著的低于甲藻种间遗传距离的统计值(0.01～0.04)[51]。Jeong等的研究[23]和本研究表明，西北、西南和东北温带太平洋地区以及地中海分离出的贪食共生藻的核糖体基因、cp23S和cob基因序列高度一致。这些来自细胞核、叶绿体和线粒体等细胞内不同位置的基因常常被用于共生藻属物种多样性和生态学研究的标记基因[12,31-32]。综合的形态和进化遗传证据表明世界各地贪食共生藻具有极其相近的亲缘关系。我们从一艘停靠在厦门港的货轮压舱水底部沉积物中分离出贪食共生藻不动细胞并且成功的培养成株系，表明其可以在船舶压舱水中长期存活，暗示世界各地的贪食共生藻可能具有共同的起源直到近代才因为人类活动扩散到世界各地。

3 结论

我们从中国沿海及一艘停靠在厦门港的货轮压舱水中分离出了4株贪食共生藻，它们的核糖体基因、cp23S和cob序列完全一致。中国沿海和世界其他地方的贪食共生藻很好的聚类在一起组成系群E。中国株系和其他地方贪食共生藻的遗传分化很小，显示它们之间有频繁的基因交流。室内培养条件下贪食共生藻生命力顽强，兼性营养能力可能是它们能够在压舱水中存活的重要原因。形态和遗传证据表明世界各地贪食共生藻具有极其相近的亲缘关系，采样记录也表明其不动细胞可以在船舶压舱水中长期存活，暗示世界各地的贪食共生藻可能具有共同的起源并且直到近代才因为人类活动扩散到世界各地。