响应面法优化同步提取黑蒜中多酚与黄酮的工艺及抗氧化活性的测定

郑清，陈宝印，杨磊，张美兰，王永强，王潇潇

(盐城工学院 海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051)

黑蒜(black garlic)，是将新鲜大蒜置于高温、高湿环境中，因新鲜大蒜自身组织发生物化变化而形成的大蒜深加工产品，黑蒜的营养成分较新鲜大蒜发生明显变化，多糖、蛋白质、多酚和氨基酸等含量随着发酵时间的增加先上升再缓慢下降，均高于新鲜大蒜的含量[1]。

黑蒜中含有丰富的生物活性物质，如低聚糖、多酚、氨基酸等，此类生物活性物质赋予黑蒜优异的抗氧化、抑菌消炎、增强免疫力等生理功能。黑蒜中的多酚类化合物是指分子结构中含有若干个酚羟基的植物成分的总称，主要包括黄酮类、酚酸类、单宁类、花色苷类等物质。黄酮类化合物是多酚的代谢产物，包含苯环与酮环结构的一类化合物，可以分为黄酮类、异黄酮类、黄烷酮类、黄酮醇类等。黑蒜中的多酚类化合物和黄酮类化合物之间存在较多相似的物化性质[2-5]。黑蒜中含有的多酚类、黄酮类化合物使得黑蒜具有较强的生物活性，同时展现出良好的保健和药理作用[6-7]，如杀菌、防流感、腹泻、强精护肝等作用。

黑蒜中所含的多酚类和黄酮类物质经物理提取法、化学提取法等方法均能获得较高的提取率。黄佳佳等以多酚提取率为评价指标，采用超声辅助提取技术对黑蒜中多酚的提取工艺参数进行优化，当提取液中乙醇浓度为20%，料液比为1∶20，超声频率为80 kHz，提取时间为40 min时，提取率为(6.15±0.50) mg/g。目前黑蒜中活性成分的研究仅以单一目标物的得率为指标对提取工艺进行优化，导致黑蒜中其他活性物质的提取效果无法兼顾[8-9]，无法实现黑蒜资源的高效开发，因此本研究同时以黑蒜中多酚类、黄酮类为优化指标，从而实现黑蒜资源的高效、综合利用。同时，为黑蒜多酚类、黄酮的分离纯化和深入研究提供了基础，并为黑蒜多酚、黄酮类物质的生理活性研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

黑蒜：山东轩逸食品有限公司；没食子酸：天津市科密欧化学试剂有限公司；福林酚、芦丁、DPPH：上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、水杨酸：上海申翔化学试剂有限公司；硝酸铝、硫酸亚铁：上海山浦化工有限公司；氢氧化钠：江苏彤晟化学试剂有限公司；无水乙醇、甲醇、水杨酸、抗坏血酸：国药集团化学试剂有限公司。

1000Y粉碎机 铂欧五金厂；AE240电子分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；GENIUS 16K-M台式高速离心机 长沙鑫奥仪器仪表有限公司；755S紫外可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；HH-3数显恒温水浴锅、DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱 金坛市岸头科辉仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 原材料的预处理

取一定量的黑蒜，切成薄片状，将其放入电热鼓风干燥箱中60 ℃烘干至恒重，用万能粉碎机粉碎后过筛，将不同粒度的黑蒜粉放入干燥器中保存备用。

1.2.2 提取工艺

称取经预处理的原料(1.00+0.02)g放置于250 mL的锥形瓶中，于30 ℃按一定比例的料液比加入提取溶剂，在规定的时间进行超声波辅助提取，提取后经离心分离。

1.2.3 黑蒜总多酚含量的测定

以没食子酸为标准品，用福林酚显色法处理后，测其在760 nm波长处的吸光度，以没食子酸含量C(mg/mL)为横坐标，以对应的吸光度值A为纵坐标，制作标准曲线[10]。得到没食子酸含量Y(mg/mL)与吸光度A的线性回归方程为y=13.534x+0.0436，R2=0.9950，对照没食子酸标准曲线得出提取液中多酚质量浓度，最后计算出黑蒜提取液中多酚含量，其公式为：

式中：W为多酚提取量，mg/g；C为福林酚法测定的提取液质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；M为黑蒜粉末质量，g。

1.2.4 黑蒜总黄酮含量的测定

黄酮含量的测定方法：以芦丁为标准品，用亚硝酸钠-硝酸铝显色法处理后，在510 nm波长处测其吸光度[11]，以芦丁含量C(mg/mL)为横坐标，以对应的吸光度值A为纵坐标，制作标准曲线。 得到芦丁含量Y(mg/mL)与吸光度A的线性回归方程为 y=1.1417x-0.0044，R2=0.9937，由标准曲线得出黄酮质量浓度，计算得出黄酮含量，公式如下：

式中：W为黄酮提取量，mg/g；C为黑蒜提取液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V为待测液体积，mL；N为稀释倍数；M为黑蒜粉末质量，g。

1.2.5 单因素实验

以黑蒜为原料，利用超声辅助溶剂浸取法对黑蒜的多酚与黄酮进行提取。

1.2.5.1 溶剂及体积分数的选择

准确称取粒径大小为100目的黑蒜干粉1.00 g放入离心管中，按料液比为1∶20分别加入体积分数为20%、40%、60%、80%、100%的甲醇、乙醇、丙酮溶液，超声提取40 min，3000 r/min离心分离15 min，吸取上清液，测定其多酚、黄酮提取量，确定最佳提取溶剂及体积分数。

1.2.5.2 超声时间的选择

准确称取粒径大小为100目的黑蒜干粉1.00 g放入离心管中，按料液比为1∶20加入体积分数为60%的丙酮溶液，分别超声提取20，40，60，80，100 min，3000 r/min离心分离15 min，吸取上清液，测定其多酚、黄酮提取量，确定最佳提取时间。

1.2.5.3 料液比的选择

准确称取粒径大小为100目的黑蒜干粉1.00 g放入离心管中，分别按料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入体积分数为60%丙酮溶液，超声提取40 min，3000 r/min离心分离15 min，吸取上清液，测定其多酚、黄酮提取量，确定最佳料液比。

1.2.5.4 粒径大小的选择

准确称取粒径大小分别为20，40，60，80，100目黑蒜干粉1.00 g放入离心管中，按料液比为1∶20加入体积分数为60%的提取溶剂，超声提取40 min，3000 r/min离心分离15 min，吸取上清液，测定其多酚、黄酮提取量，确定最佳粒径大小。

1.2.6 响应面优化黑蒜中多酚及黄酮同步提取工艺

根据单因素结果，利用Design-Expert 8.0软件中Box-Behnken中心组合实验设计原理，以黑蒜中多酚、黄酮提取量为响应值，以溶剂浓度、超声时间、料液比、粒径大小4个因素3个水平进行响应面实验设计，见表1。

表1 Box-Behnken设计因素水平及编码值Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.2.7 黑蒜体外抗氧化能力的测定

取最优工艺下黑蒜提取液分别稀释至多酚和黄酮总浓度为2，4，6，8，10，12 μg/mL，测定黑蒜提取液对DPPH自由基的清除能力，黑蒜提取液中多酚和黄铜总浓度为40，80，120，160，200，240 μg/mL时测定黑蒜提取液对羟自由基和超氧阴离子的清除能力。

1.2.7.1 黑蒜提取液对DPPH自由基的清除能力

参照赵聪[12]的方法略有改动，取一定浓度的黑蒜提取液2 mL，加入2 mL， 0.2 mmol/L 的DPPH溶液摇匀，置于暗处反应30 min，测定其在517 nm波长处的吸光度A1；取黑蒜提取液2 mL，加入2 mL无水乙醇摇匀，测定吸光度A0；分别取蒸馏水和0.2 mmol/L DPPH溶液各2 mL充分摇匀，测定吸光度A2。以样品浓度对DPPH自由基的清除率绘制曲线，计算清除DPPH自由基的IC50值。以蒸馏水调零，以同浓度的Vc做阳性对照。

1.2.7.2 黑蒜提取液对羟自由基的清除能力

参照赵鹏雲[13]的方法略有改动，取1.8 mmol/L FeSO4、1.8 mmol/L水杨酸-乙醇溶液及样品溶液各1 mL混匀，再加入1 mL 的1.76 mmo1/L H2O2溶液，在37 ℃下恒温反应30 min，测定其在510 nm处的吸光度值A1；取样品溶液1 mL、乙醇3 mL混匀，测定其在510 nm处的吸光度值A0；以蒸馏水代替样品溶液测定不加抗氧化剂溶液体系在510 nm处的吸光度值A2。按下式计算不同浓度样品溶液对羟自由基的清除率，以样品浓度对羟自由基的清除率绘制曲线，计算清除羟自由基的IC50值。以蒸馏水调零，以同浓度的Vc做阳性对照。

1.2.7.3 黑蒜提取液对超氧阴离子的清除能力

参照袁磊等[14]的方法略有改动，取Tris-HCl缓冲液4.5 mL、样品液1 mL及25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，混匀后于25 ℃水浴反应，在4 min时，向体系中加入8 mmol/L的盐酸1 mL终止反应，在波长320 nm处测定吸光度值A1。实验中以无水乙醇代替邻苯三酚溶液的吸光值为A0，以蒸馏水代替样品溶液的吸光值为A2。按下式计算不同浓度样品溶液对超氧阴离子的清除率，以样品浓度对超氧阴离子的清除率绘制曲线，计算清除超氧阴离子的IC50值。以蒸馏水调零，以同浓度的Vc做阳性对照。

1.3 数据处理

数据结果采用3次平行实验的平均值±标准偏差来表示，同时使用SPSS处理软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同溶剂及体积分数对黑蒜中多酚、黄酮提取量的影响

由图1～图3可知，随着溶剂体积分数的增大，甲醇、乙醇提取多酚的量逐渐减少，丙酮提取多酚的量先增加后减少，可能的原因是黑蒜中多酚类物质极性较大，随着溶剂体积分数的增加，提取剂极性减小，从而导致对多酚的提取率下降，溶剂体积分数增加的同时会使其他非极性物质与多酚竞争性地溶出，也会使多酚提取量减少；随着溶剂体积分数的增大，黄酮提取量先增加后减少，可能的原因是随着溶剂体积分数的增大，使黄酮类物质与蛋白质、多糖等之间的氢键遭到破坏，从而使黄酮溶出，当体积分数继续增大时，高浓度溶剂会使蛋白质凝固，不利于黄酮溶出。40%丙酮对黑蒜多酚提取效果最好，60%乙醇对黑蒜黄酮提取效果最好。当提取液为40%的丙酮时，黑蒜提取液中多酚和黄酮含量分别为12.41 mg/g和0.36 mg/g，提取液中多酚和黄酮的含量明显高于40%的甲醇和乙醇提取溶液，综合考虑，选取丙酮作为提取剂，以体积分数40%为优化中心。

图1 甲醇体积分数对多酚、黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of methanol volume fraction on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

图2 乙醇体积分数对多酚、黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

图3 丙酮体积分数对多酚、黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of acetone volume fraction on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

2.1.2 超声时间对黑蒜中多酚、黄酮提取量的影响

由图4可知，多酚提取量随着提取时间的增加逐渐增加，可能是时间较短多酚不能完全提取，随着时间的增加，溶出物逐渐增多；黄酮提取量随着提取时间的增加先减少后增加，可能的原因是随着提取时间的增加，超声过程中黄酮具有的酚羟基发生化学反应，使提取率下降，提取时间继续增加，黄酮类物质溶出量增多。因此选取80 min为优化中心。

图4 超声时间对多酚、黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

2.1.3 料液比对黑蒜中多酚、黄酮提取量的影响

由图5可知，料液比逐渐增加时，多酚、黄酮提取量先增加后减少，可能的原因是在一定范围内增大料液比，黑蒜多酚、黄酮溶质间的浓度差增大，有利于物质溶出，因此使提取量增加，达到峰值后，料液比继续增大会使其他物质溶出增多，对多酚，黄酮的溶出形成竞争性抑制，从而阻止多酚、黄酮的溶出，因此选取料液比1∶25为优化中心。

图5 料液比对多酚、黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

续 表

续 表

2.1.4 粒径大小对黑蒜中多酚、黄酮提取量的影响

由图6可知，随着粒径的减小，多酚、黄酮的提取量先增加后减少，可能的原因是随着粒径的减小，比表面积增加，有利于多酚、黄酮的充分溶出，当粒径增加到80目时，黑蒜粉在溶剂中容易粘结成块，不宜分散，导致提取量减少。当黑蒜粒径为60目时，黑蒜取液中多酚和黄酮含量分别为7.78 mg/g和1.00 mg/g，因此选取60目为优化中心。

图6 粒径大小对多酚、黄酮提取量的影响Fig.6 Effect of particle size on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

2.2 响应面法优化多酚与黄酮的提取工艺

2.2.1 响应面分析及结果

根据单因素实验结果，以丙酮为溶剂，选用丙酮浓度(A)、超声时间(B)、料液比(C)、粒径大小(D)为自变量，以总多酚、总黄酮为响应值进行优化响应面。实验方案及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 模型的建立及其显著性检验

用Design Expert 8.0对表2中数据进行回归分析，结果见表3。

表3 多酚提取量回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model of polyphenol extraction amount

多酚提取量回归方程为：Y1=12.70+0.63A+1.84B+0.079C+0.25D+0.41AB+0.67AC-0.29AD+0.29BC-0.078BD-0.22CD-1.57A2-0.34B2-1.39C2-0.59D2。

(1)

2.2.3 黄酮提取量回归模型方差分析

黑蒜黄酮提取量的二次回归模型方差分析见表4，该模型 P<0.0001(差异极显著)，回归系数 R2=0.9588，表明该模型可以95%的匹配数据，因此该回归模型可用于黑蒜黄酮提取工艺条件的预测和分析。丙酮体积分数、提取时间、料液比、粒径大小均对提取效果影响极为显著；交互因素AB、AC及A2、B2、C2、D2对黑蒜黄酮提取量影响极为显著。综合分析各因素P值和F值，可得影响黑蒜黄酮提取量的因素主次为：提取时间>料液比>丙酮体积分数>粒径大小，各交互因素中对黑蒜黄酮提取量影响程度最大的为AB，影响程度最小的为AD。

表4 总黄酮提取量回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model of flavonoid extraction amount

黄酮提取量回归方程为：Y2=1.65+0.059A+0.23B+0.12C+0.047D+0.13AB+0.072AC-0.009937AD-0.065BC-0.067BD+0.023CD-0.18A2-0.099B2-0.21C2-0.11D2。

(2)

对上述两个回归模型进行方差分析，见表3和表4。方差分析中，模型的一次项A，B，D，交互项AB、AC、AD、BC，二次项A2、B2、C2、D2对多酚提取率的影响是极显著的(P<0.01)，交互项CD对酚提取率的影响是显著的(P<0.05)。在方程(2)中A，B，C，D，交互项AB、AC，二次项A2、B2、C2、D2对黄酮提取率影响是极显著的(P<0.01)，交互项BC、BD对黄酮提取率的影响是显著的(P<0.05)。由方差分析结果可以看出，两个二次回归方程整体模型极显著(P<0.01)，Y1的回归系数R2=0.9305，Y2的R2=0.9588，失拟项都不显著，说明两个方程拟合较好，数学模型稳定，可以对不同提取条件下黑蒜的多酚、黄酮提取率结果进行预测。

综合分析各因素的P值和F值，可得影响黑蒜多酚提取量的因素主次为：超声时间>丙酮体积分数>粒径大小>料液比，各交互因素中对黑蒜多酚提取量影响程度最大的为AC，影响程度最小的为BD。可得影响黑蒜黄酮提取量的因素主次为：超声时间>料液比>丙酮体积分数>粒径大小。

2.2.4 响应面回归模型验证

综合考虑黑蒜多酚、黄酮提取得率，对响应曲面二次回归方程优化结果进行分析，通过对回归方程及三维响应面图的综合分析，得出黑蒜多酚、黄酮的最优提取工艺条件为：丙酮体积分数60%、提取时间96.46 min、料液比1∶24.92、粒径大小60.91目。为了方便验证模型的有效性，取丙酮体积分数60%、提取时间96 min、料液比1∶25、粒径大小60目，在此工艺条件下得到多酚、黄酮提取量分别为13.31 mg/g和1.71 mg/g(实验3次取平均值)，响应面模型预测值分别为13.36 g/mg和1.75 g/mg，实验验证值与预测值非常接近，该二次回归模型能有效地反映各因素对黑蒜多酚、黄酮提取量的影响，该回归方程可行有效。

2.3 黑蒜提取物抗氧化性比较

2.3.1 黑蒜提取液对DPPH自由基清除能力的测定

黑蒜提取液对DPPH自由基的清除能力见图7。

图7 黑蒜提取液和Vc对DPPH自由基的清除能力Fig.7 The scavenging ability of black garlic extract and VC on DPPH free radical注：“*”表示差异显著(P<0.05)，“**”表示差异极显著(P<0.01)。

由图7可知，黑蒜提取液对DPPH自由基的清除能力很强，且高于同浓度的Vc。黑蒜提取液中多酚、黄酮总浓度和Vc浓度从2 μg/mL增加到12 μg/mL时，其去除DPPH自由基的能力分别从5.5%和2.3%增加到31.7%和16.1%。黑蒜多酚、黄酮和Vc清除DPPH自由基的IC50值分别为18.29 μg/mL和36.32 μg/mL。

2.3.2 黑蒜提取液对羟基自由基清除能力的测定

黑蒜提取液对羟基自由基的清除能力见图8。

图8 黑蒜提取液和Vc对羟基自由基的清除能力Fig.8 The scavenging ability of black garlic extract and VC on hydroxyl free radical注：“*”表示差异显著(P<0. 05)，“**”表示差异极显著(P<0. 01)。

由图8可知，黑蒜提取液对羟基自由基有很强的清除能力，且清除能力远远高于同浓度的Vc。黑蒜提取液和Vc对羟基自由基的清除能力与其浓度呈现良好的量效关系。黑蒜提取液中多酚、黄酮总浓度和Vc浓度从40 μg/mL增加到240 μg/mL时，其清除羟基自由基的能力分别从10.2%和2.6%增加到88.0%和16.3%。黑蒜多酚、黄酮和Vc清除羟基自由基的IC50值分别为142 μg/mL和794 μg/mL。

2.3.3 黑蒜提取液对超氧阴离子清除能力的测定

黑蒜提取液对超氧阴离子的清除能力见图9。

由图9可知，黑蒜提取液对超氧阴离子有较强的清除能力，且清除能力远远高于同浓度的Vc，黑蒜提取液和Vc对超氧阴离子的清除能力与其浓度呈现良好的量效关系。黑蒜提取液中多酚、黄酮总浓度和Vc浓度从40 μg/mL增加到240 μg/mL时，其清除超氧阴离子的能力分别从8.71%和6.3%增加到57.6%和37.8%。黑蒜多酚、黄酮和Vc清除超氧阴离子的IC50值分别为224 μg/mL和330 μg/mL。

3 结论

本研究在单因素的基础上，采用响应面法优化同步提取黑蒜中多酚和黄酮，得到最优提取工艺条件为：丙酮体积分数60%、提取时间96 min、料液比1∶25、粒径大小60目。多酚、黄酮提取量分别为13.31 mg/g和1.71 mg/g，与理论值13.36 mg/g和1.75 mg/g接近。

本研究采用体外抗氧化评价模型，以Vc对照评价黑蒜提取液具有良好的DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子清除能力，随着黑蒜提取物浓度的增加，其抗氧化能力亦不断提高。黑蒜提取液中多酚、黄酮总浓度和Vc浓度从2 μg/mL增加到12 μg/mL时，其清除DPPH自由基的能力从5.5%增加到31.7%；黑蒜提取液中多酚、黄酮总浓度和Vc浓度从40 μg/mL增加到240 μg/mL时，其清除羟基自由基的能力从10.2%增加到88.0%；其清除超氧阴离子的能力从8.71%增加到57.6%。在相同浓度下，黑蒜提取物的DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子的清除能力均高于Vc。本研究为黑蒜资源的高附加值开发利用提供了一定的理论依据。