线粒体和溶酶体内源性NO的同时荧光传感

方君如，苗俊峰，霍莹莹，翁嘉劲，郭炜

（山西大学 化学化工学院，山西 太原 030006）

0 引言

一氧化氮（NO）是生物体内重要的气体信使分子，在细胞内由L-精氨酸、NADPH和氧气在一氧化氮合成酶的催化下产生[1-5]，并在一系列生理系统，如心血管、免疫和中枢神经等，发挥着重要的生理功能[6-8]。研究表明，NO主要产生于细胞内的线粒体[9-10]，通过结合细胞色素c氧化酶的血色素基团和调节线粒体内的pH来参与调控呼吸作用和线粒体引起的细胞凋亡[11-12]；而且，NO可以穿透线粒体膜而自由扩散到溶酶体中来调节溶酶体相关功能，如细胞自噬[13-15]。然而，不正常的生理条件会导致NO的过量表达，从而引起其下游氧化产物过氧亚硝基（ONOO-）的爆发。ONOO-具有极强的氧化性，能氧化损伤线粒体和溶酶体内的各种生物大分子，导致其功能丧失，从而引发系列疾病，例如癌症、糖尿病、高血压、老年痴呆以及溶酶体贮积症等[4]。尽管如此，由于生物系统的复杂性，许多与NO相关的线粒体和溶酶体功能迄今尚未被揭示[16-17]。因此，开发能特异性传感线粒体和溶酶体内源性NO的荧光探针显得尤为重要。

在过去十几年间，为了监测细胞内NO的变化，大量的NO荧光探针被开发出来。在各种类型的NO荧光探针中，基于邻苯二胺反应基团的NO荧光探针最早被开发，其后被广泛应用，目前已经商业化[18-23]。该类探针对NO的传感机理是：邻苯二胺反应基团在有氧条件下与NO反应生成苯并三氮唑基团，该基团抑制了探针分子的光诱导电子转移猝灭过程（PET），从而导致荧光“关-开”响应[24]。尽管该类探针在生物系统中得到了广泛的应用，但仍然存在一些限制，如易被细胞内脱氢抗坏血酸（DHA）/抗坏血酸（AA）/丙酮醛（MGO）所干扰以及相对长的荧光响应时间（通常超过5 min）。为了克服这些限制，2008年Xu课题组报道了一个“邻苯二胺-罗丹明内酰胺”型NO荧光探针。由于邻苯二胺基团的一个胺基得到了保护，该探针有效地克服了传统邻苯二胺型NO荧光探针选择性低的缺点，并大大提高了荧光响应速度[25]。此后，该设计理念被多个课题组采用，并发展出各式各样的罗丹明内酰胺型NO荧光探针[26-30]。然而，该类探针与NO反应后得到的酰基苯并三氮唑中间体非常活泼，能与细胞内丰富的半胱氨酸反应而得到非荧光的产物，因此在细胞影像应用时灵敏度将受到较大的影响。2017年，本课题组开发了一个“邻苯二胺-硅罗丹明脱氧内酰胺”型 NO荧光探针 Lyso-NO[31]（图1A）。该探针不仅避免了传统邻苯二胺型NO荧光探针易被DHA/AA/MGO干扰的限制以及罗丹明内酰胺型NO荧光探针易被细胞内半胱氨酸干扰的限制，而且展现出对NO快速的荧光响应、大的荧光增强倍数以及超低的检测限。不仅如此，由于该探针的结构中包含了多个弱碱性的三级胺单元，该探针能通过质子化作用而选择性地定位在弱酸性的溶酶体中，从而实现了溶酶体中NO的荧光影像。

图1 Lyso-NO和Mito-NO的NO传感机理Fig.1 Fluorescence sensing mechanism of Lyso-NO and Mito-NO for NO.

在上述工作基础上，本文设计合成了一个“邻苯二胺-罗丹明脱氧酰胺”型NO荧光探针Mito-NO（图1B）。与硅罗丹明的9位碳原子相比，罗丹明9位碳原子的电正性略小[32-33]，因此Mito-NO在生理pH条件下以开环的正离子形式存在。由于线粒体具有大的负性膜电势，Mito-NO能在静电相互作用下而特异性地靶向线粒体，从而实现了线粒体内NO的荧光影像。基于该探针并结合本课题组之前报道的一个溶酶体靶向的NO荧光探针Lyso-NO，本文从可见及近红外两个荧光通道实现了线粒体和溶酶体内NO的同时荧光传感，为NO生理病理功能的探索提供了优良的影像工具。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

紫外可见光谱仪Varian Cary 4000分光光度计；荧光光谱仪Hitachi F-7000荧光光谱仪；超导核磁共振仪Bruker ARX600；高分辨质谱仪Varian QFT-ESI质谱仪；激光共聚焦显微镜Zeiss LSM 880。合成所用试剂都为分析纯，测试所用乙腈为色谱纯试剂，所用水均为去离子水。

1.2 探针的合成

探针Lyso-NO的合成参考本课题组报道的方法[26]。

探针Mito-NO的合成步骤如图2所示。

图2 探针Mito-NO的合成步骤Fig.2 Synthesis of probe Mito-NO

在室温下，向罗丹明 B（1）（422 mg，1.0 mmol）的1，2-二氯乙烷（5.0 mL）溶液中缓慢滴加三氯氧磷（460 mg，3.0 mmol）。回流4 h后，将反应混合物冷却并减压旋干，得到罗丹明B的酰氯粗产品。将该产物溶于无水乙腈（5.0 mL）中，然后将其缓慢加入到含有三乙胺（5.0 mL）和邻苯二胺（OPD）（540 mg，5.0 mmol）的无水乙腈（5.0 mL）的溶液中。室温下搅拌过夜后，将混合物减压旋干，粗产物通过硅胶柱色谱纯化（乙酸乙酯：石油醚=1∶4，V/V），得到邻苯二胺-罗丹明内酰胺2（266 mg，50% yield，除特别说明以外本文的百分数均表示质量分数）。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.04（dd，J=6.4，1.7 Hz，1H），7.65～ 7.51（m，2H），7.27（dd，J=6.3，1.4 Hz，1H），6.97（td，J=8.0，1.4 Hz，1H），6.66（d，J=8.8 Hz，2H），6.57（dd，J=8.0，1.0 Hz，1H），6.49～ 6.40（m，1H），6.38～ 6.21（m，4H），6.12（dd，J=7.9，1.1 Hz，1H），3.33（dd，J=13.8，6.9 Hz，8H），1.17（t，J=7.0 Hz，12H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ166.44，153.98，152.40，148.91，144.52，132.63，131.95，128.83，128.75，128.67，128.37，124.30，123.46，122.18，118.22，117.01，107.98，98.03，68.06，44.40，12.53；ESI-MS：Calcd for[M+H]+533.291 7，Found 533.291 1。

在室温条件下，将邻苯二胺-罗丹明内酰胺2（106 mg，0.2 mmol）加入到超干 THF（5ml）溶液中，在N2气保护下滴加硼烷BH3的四氢呋喃溶液（1 mol/L，THF，1.1 mmol）。回流 12 h后，将反应物冷却并加入甲醇（5 mL）猝灭。将所得反应物减压旋干，硅胶柱色谱纯化（乙酸乙酯：石油醚=1∶5，V/V）后得到紫色固体 Mito-NO（56 mg，51% yield）。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ7.78（d，J=7.6 Hz，1H），7.58（t，J=7.6 Hz，1H），7.45（t，J=7.5 Hz，1H），7.11（d，J=7.4 Hz，1H），7.07（d，J=9.3 Hz，2H），6.81～ 6.73（m，4H），6.50（dd，J=25.4，7.1 Hz，3H），6.17（d，J=7.6 Hz，1H），4.25（s，2H），3.63（q，J=6.9 Hz，8H），1.34（t，J=7.0 Hz，12H）；13C NMR（151 MHz，CD3CN）δ153.46，148.92，141.35，136.88，132.63，132.05，129.38，128.95，127.59，125.73，121.29，118.33，116.53，115.4，112.69，108.75，97.11，68.69，58.67，43.75，14.53；ESI-MS：Calcd for[M]+519.311 8，Found 519.305 7。

1.3 待测溶液的配制

探针Mito-NO和Lyso-NO溶解到色谱纯的乙腈中，配制成2 mmol/L的储备液。NO水溶液的制备是在N2保护下将NO气体首先通过NaOH溶液以除去由NO和O2反应产生的NO2，然后通入脱氧的去离子水中30 min，得到的NO溶液由Griess方法测定其浓度为1.8 mmol/L。细胞成像实验中，使用市售的NO供体NOC-9。在光谱研究中，将不同的分析物（·OH and1O2除外）分别加入到Mito-NO（或 Lyso-NO）（4.0 μmol/L）的 PBS 溶液中（50 mmol/L，pH7.4，包含20% 体积DMSO 或CH3CN），然后记录吸收和荧光发射光谱。对于·OH和1O2，首先将 Mito-NO（或 Lyso-NO）和 H2O2预混合，然后向混合物中加入Fe2+或ClO-。

2 结果与讨论

2.1 探针Mito-NO对NO的传感性能研究

首先，我们检验了探针Mito-NO与NO反应的吸收光谱变化。如图3A所示，在生理pH条件下，探针Mito-NO在可见光波长范围出示了一个大的吸收峰，吸收最大值为553 nm，表明该探针主要以开环形式存在；当向Mito-NO的溶液中加入NO（30 μmol/L）后，由于生成的苯并三氮唑基团对罗丹明的共轭结构影响很小，因此吸收光谱仅仅发生了轻微的变化。随后，我们检验了探针Mito-NO与NO反应的荧光光谱变化。如图3B所示，探针Mito-NO在生理pH条件下几乎是非荧光的，表明该探针存在一个由邻苯二胺基团到罗丹明共轭结构的PET荧光淬灭过程；当往Mito-NO的溶液中加入NO（30 μmol/L）后，在588 nm处出现了一个大的荧光发射峰，荧光增强倍数达到96倍，表明生成的苯并三氮唑基团有效地抑制了探针分子的PET荧光猝灭，从而导致荧光大大增强。重要的是，Mito-NO与NO的反应能够在数秒内完成（图3C），表明探针Mito-NO具有实时影像生物体内NO的能力。荧光滴定实验进一步表明，随着NO浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当增加的NO浓度达到80 μmol/L时，荧光达到最大值（图3D），而且荧光强度与NO浓度在0 μmol/L～ 1.0 μmol/L范围呈现良好的线性相关（R2=0.994）（图3E）。根据信噪比S/N=3，计算得到探针Mito-NO对NO的检测限为2.4 nmol/L。上述结果表明，探针Mito-NO是一个高敏感、快响应的NO荧光探针。

图3 （A，B）Mito-NO（4 μmol/L）与NO（30 μmol/L）反应前后的吸收光谱和荧光光谱变化；（C）Mito-NO（4 μmol/L）与NO（30 μmol/L）的反应动力学；（D）Mito-NO（4 μmol/L）与NO（0 μmol/L ～ 80 μmol/L）的荧光滴定光谱；（E）Mito-NO在588 nm处的荧光密度与NO浓度（0 mol/L～1 mol/L）的线性相关Fig.3 （A，B）Absorption and fluorescence spectra of Mito-NO（4 μmol/L）in the absence and presence of NO（30 μmol/L）；（C）Time course of fluorescence intensities of Mito-NO（4 μmol/L）at 588 nm upon treatment with NO（30 μmol/L）；（D）Fluorescence spectra of Mito-NO（4 μmol/L）treated with various concentrations of NO（0-80 μmol/L）；（E）Plots of the fluorescence intensities of Mito-NO at 588 nm vs.NO concentrations（0-1.0 μmol/L）

接下来，我们检验了探针Mito-NO对NO的选择性。如图4A所示，当向探针Mito-NO的PBS溶液中加入生物相关的活性氧化物（ROS：ClO-，H2O2，1O2，O2·-，·OH，NO2-和 ONOO-，100 μmol/L）、DHA/AA/MGO（1 mmol/L）、金属离子（K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Al3+，Zn2+，Fe2+，Fe3+，Cu+，and Cu2+，1 mmol/L）、生物硫醇（Cys and GSH，1 mmol/L）后，溶液的荧光几乎没有变化；相反，当向探针Mito-NO的PBS溶液中加入NO（30 μmol/L）后，溶液的荧光显著增强，表明探针Mito-NO对NO具有高的选择性。进一步，我们在不同pH条件下检验了探针Mito-NO对NO传感性能。如图4B所示，探针Mito-NO在pH=5～9的范围内均呈现非荧光特性；当加入NO（30 μmol/L）后，在生理pH范围展现了大的荧光增强，表明该探针能在复杂的生理pH条件下高选择性地传感NO。

图4 （A）Mito-NO 对各种生理相关的分子或离子的荧光响应结果。（1）Mito-NO；（2）HClO；（3）H2O2；（4）1O2；（5）O2·-；（6）·OH；（7）NO2-；（8）ONOO-；（9）DHA；（10）AA；（11）MGO；（12）K+；（13）Ca2+；（14）Na+；（15）Mg2+；（16）Al3+；（17）Zn2+；（18）Fe2+；（19）Fe3+；（20）Cu+；（21）Cu2+；（22）Cys；（23）GSH；（24）NO；（B）Mito-NO 在不同pH条件下对NO的荧光响应结果Fig.4 （A）Fluorescence response of Mito-NO（4 μmol/L）toward various biologically related species，including（1）Mito-NO；（2）HClO；（3）H2O2；（4）1O2；（5）O2·-；（6）·OH；（7）NO2-；（8）ONOO-；（9）DHA；（10）AA；（11）MGO；（12）K+；（13）Ca2+；（14）Na+；（15）Mg2+；（16）Al3+；（17）Zn2+；（18）Fe2+；（19）Fe3+；（20）Cu+；（21）Cu2+；（22）Cys；（23）GSH；（24）NO；（B）Fluorescence response of Mito-NO（4 μmol/L）toward NO（30 μmol/L）under varied pH conditions

为了证明反应机理，我们用高效液相色谱-质谱联用仪研究了探针Mito-NO与NO的反应产物。如图5所示，探针Mito-NO本身的液相色谱保留时间为12.42 min，相应的分子离子峰的质核比为519.312 5；探针Mito-NO与NO反应后生成了一个主要产物（保留时间：8.89），该产物分子离子峰的质核比为m/z=530.291 5，与预测的苯并三氮唑产物一致（计算值：m/z=530.291 4）。该结果支持了我们在图1中建议的反应机理。

图5 Mito-NO与NO反应前后的液相色谱-质谱检测结果Fig.5 HPLC-MS results of Mito-NO in the absence（A）and presence（B）of NO

2.2 细胞影像实验

接下来，我们利用激光共聚焦影像仪在HeLa细胞系测试了探针Mito-NO对NO的影像能力。如图6A所示当往HeLa细胞内孵入探针Mito-NO后，在561 nm激发光激发下，几乎没有可检测的背景荧光；当往孵有Mito-NO的HeLa细胞内孵入NOC-9（商业化的NO供体）后，该细胞在红色通道呈现出强荧光，表明Mito-NO能在细胞环境中影像外源性NO；当往孵有Mito-NO的HeLa细胞内分别加入H2O2、ClO-、SIN-1（商业化的 ONOO-供体）后，红色通道没有观察到明显的荧光，暗示了该探针能在细胞中选择性影像NO。进一步，我们在RAW264.7细胞系测试了探针Mito-NO对内源性NO的影像能力。如图6B所示，在激发光激发下，RAW264.7本身没有荧光，然而当孵入Mito-NO后，该细胞呈现微弱的荧光；当RAW264.7细胞预先用γ-干扰素/脂多糖（IFN-γ/LPS）刺激6 h再孵入探针Mito-NO后，该细胞在红色通道呈现明显的荧光；当在IFN-γ/LPS刺激的同时加入NO合成酶抑制剂AG（或L-Name），然后再孵入探针Mito-NO，该细胞在红色通道仅呈现微弱的荧光。上述结果表明，探针Mito-NO不仅能检测RAW264.7细胞内生理浓度的NO，而且能检测该细胞刺激产生的内源性NO。另外，我们也研究了Mito-NO的光稳定性和抗光漂白能力。如图6C所示，当用激发光连续激发孵有Mito-NO的HeLa细胞30 min后，该细胞仍然呈现低的背景荧光，表明该探针具有较强的抗光氧化能力；当用激发光连续激发孵有Mito-NO和NOC-9的HeLa细胞30 min后，细胞在红通道的荧光没有明显减弱，表明探针Mito-NO与NO的反应产物具有良好的抗光漂白性能。

图6 （A）HeLa细胞外源性NO的共聚焦影像结果，在该试验中，细胞分别用Mito-NO，Mito-NO/NOC-9，Mito-NO/SIN-1，Mito-NO/H2O2，和 Mito-NO/ClO-处理；（B）RAW264.7内源性NO的共聚焦荧光影像结果，在该试验中，细胞分别用Mito-NO，LPS/INF-γ/Mito-NO，LPS/INF-γ/AG/Mito-NO，和LPS/INF-γ/L-Name/Mito-NO处理；（C）探针Mito-NO的抗光氧化和抗光漂白能力的检测结果，在该实验中，负载Mito-NO和Mito-NO/NOC-9的HeLa细胞分别用561 nm激光器连续照射30 min，然后进行共聚焦荧光影像Fig.6 （A）Confocal images of HeLa cells pretreated with Mito-NO（2 μmol/L）and then treated with NOC-9（20 μmol/L），SIN-1（0.5 mmol/L），H2O2（0.5 mmol/L），and ClO-（0.5 mmol/L），respectively.（B）Confocal images of RAW264.7 cells treated with Mito-NO（2 μmol/L）only，or pretreated with LPS（20 mg/mL）/INF-γ（150 units/mL）for 6 h and then treated with Mito-NO（2 μmol/L），or pretreated with LPS（20 mg/mL）/INF-γ（150 units/mL）in the presence of AG（2 mmol/L）or L-Name（10 μmol/L）for 6 h and then treated with Mito-NO（2 μmol/L），respectively.（C）Confocal images of Mito-NO-loaded HeLa cells continuously excited by 561 nm laser for 30 min in the absence and presence of NOC-9.Emission was collected at 566-650 nm（λex=561 nm）

为了验证Mito-NO的亚细胞器定位能力，我们进行了共染实验。在该实验中，我们将探针Mito-NO与商业化亚细胞器靶向荧光探针（内质网探针ER Tracker，溶酶体探针Lyso Tracker，线粒体探针Mito Tracker）同时孵入HeLa细胞中，然后加入NOC-9点亮探针在红色通道的荧光。如图7A所示，共染实验表明，Mito-NO与NO反应产物的荧光影像与内质网探针和溶酶体探针的重叠效果较差，皮尔森系数分别仅为0.35和0.25；然而与线粒体探针呈现良好的重叠影像，皮尔森系数可达0.88，表明探针与NO的反应产物主要定位于线粒体。为了进一步探测Mito-NO本身的定位情况，我们提高了共聚焦荧光影像仪的激光强度来获得可观测的Mi-to-NO本身的弱荧光，并在该条件下进行了共染实验。如图7B所示，Mito-NO本身与线粒体靶向探针呈现良好的共定位，皮尔森系数为0.8，而与内质网和溶酶体探针的共定位效果较差，皮尔森系数分别仅为0.35和0.28。这些结果表明，探针Mito-NO及其与NO的反应产物均能特异性靶向细胞的线粒体。

图7 （A）HeLa细胞中，探针Mito-NO（2 μmol/L）与NO的反应产物与商业化内质网探针ER-Tracker Green（1 μmol/L）、溶酶体探针Lyso Tracker Green DND-26（0.07 μmol/L）以及线粒体探针Mito Tracker green FM（0.2 μmol/L）的共染影像结果；（B）HeLa细胞中，探针Mito-NO（2 μmol/L）与商业化内质网探针ER-Tracker Green（0.2 μmol/L）、溶酶体探针 Lyso Tracker Green DND-26（0.02 μmol/L）以及线粒体探针Mito Tracker green FM（0.05 μmol/L）的共染影像结果，激发和收集波长：Mito-NO：λex=561 nm，λem=566 nm～650 nm；Mito Tracker/Lyso Ttracker/ER-Tracker：λex=488 nm，λem=493 nm～550 nmFig.7 （A）Confocal images of HeLa cells co-stained with Mito-NO（2 μmol/L）/ER-Tracker Green（1 μmol/L），Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso Tracker Green DND-26（0.07 μmol/L），and Mito-NO（2 μmol/L）/Mito Tracker green FM（0.2 μmol/L），and then treated with NOC-9（30 μmol/L）；（B）Confocal images of HeLa cells co-stained with Mito-NO（2 μmol/L）/ER-Tracker Green（0.2 μmol/L），Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso Tracker Green DND-26（0.02 μmol/L），and Mito-NO（2 μmol/L）/Mito-Tracker green FM（0.05 μmol/L）.For Mito-NO，emission was collected at 566 nm-650 nm（λex=561 nm）；for ER-Tracker/Lyso-Tracker/Mito Tracker，emission was collected at 493 nm-550 nm（λex=488 nm）

利用Mito-NO和本课题组之前报道的溶酶体NO探针Lyso-NO进行了同时荧光影像线粒体和溶酶体内源性NO的实验。在该实验中，我们将Mito-NO、Lyso-NO 以及 Mito Tracker（或 Lyso Tracker）同时孵入内皮EA.hy926细胞，然后将该细胞置于“氧糖剥夺-再灌氧（OGD/RO）”条件下以刺激该细胞产生内源性NO。如图8A所示，共聚焦影像结果表明，探针Mito-NO与线粒体探针的荧光影像重叠良好，皮尔森系数高达0.82，表明该探针能靶向线粒体并影像线粒体内源性NO；而探针Lyso-NO与Mito-NO以及线粒体探针的荧光影像基本没有重叠，皮尔森系数仅为0.41和0.45。如图8B所示，探针Lyso-NO与溶酶体探针的荧光影像重叠良好，皮尔森系数高达0.84，表明该探针能靶向溶酶体并影像溶酶体内源性NO；然而Mito-NO与Lyso-NO以及Lyso Tracker的荧光影像基本没有重叠，皮尔森系数仅为0.31和0.24。这些结果表明，Mito-NO和Lyso-NO能同时在一个细胞内荧光影像线粒体和溶酶体内源性NO，且相互不干扰，因此是研究线粒体和溶酶体内NO生理功能的良好影像工具。

图8 （A）EA.hy926细胞经氧糖剥夺-再灌氧、Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso-NO（2 μmol/L）/Mito Tracker Green DND-26（0.2 μmol/L）共染后的荧光影像图；（B）EA.hy926细胞经氧糖剥夺-再灌氧、Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso-NO（2 μmol/L）/Lyso Tracker Green DND-26（0.07 μmol/L）共染后的荧光影像图；激发和收集波长：Mito-NO：λex=561 nm，λem=566 nm～650 nm；Lyso-NO：λex=633 nm，λem=638 nm～750 nm；Mito Tracker/Lyso Ttracker：λex=488 nm，λem=493 nm～550 nmFig.8 （A）Confocal images of EA.hy926 cells subjected to OGD（2 h）/RO（1 h）and then co-stained with Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso-NO（2 μmol/L）/Mito Tracker Green DND-26（0.2 μmol/L）.（B）Confocal images of EA.hy926 cells subjected to OGD（2 h）/RO（1 h）and then co-stained with Mito-NO（2 μmol/L）/Lyso-NO（2 μmol/L）/Lyso Tracker Green DND-26（0.07 μmol/L）.For Mito-NO，emission was collected at 566 nm-650 nm（λex=561 nm）；for Lyso-NO，emission was collected at 638 nm-750nm（λex=633 nm）；for Lyso-Tracker/Mito Tracker，emission was collected at 493 nm-550 nm（λex=488 nm）

3 结论

本文设计合成了一个线粒体靶向的罗丹明脱氧酰胺型NO荧光探针Mito-NO，并在模拟生理条件下以及细胞内证实了该探针能高选择性、高灵敏性检测线粒体内源性NO。结合本课题组之前报道的一个溶酶体靶向的硅罗丹明脱氧内酰胺型NO荧光探针Lyso-NO，本文成功地实现了线粒体和溶酶体内源性NO的同时荧光影像。本工作为NO生理病理的深层次研究提供了优良的荧光影像工具。