精索静脉曲张对孕前男性精浆生化及精子DNA 完整性的影响

阮衍泰 郜 亮 徐贵江 张 坡

1. 扬州大学医学院附属医院，扬州市妇幼保健院男科（江苏扬州 225002）；2. 扬州市邗江区妇幼保健所男科；3. 扬州大学医学院附属医院，扬州市妇幼保健院生殖中心

精索静脉曲张（varicocele，VC）是男性生殖系统常见病，是手术可以矫治的导致男性不育的主要原因。 精浆是由前列腺、精囊腺、附睾、尿道球腺等附属性腺的分泌物混合而成，含有维持精子生存的各种营养成分，是精子运动的必须介质， 精浆成分的变化可影响精子的功能。 精子DNA 完整性能够反映出精子DNA 的损伤情况，有效预测男性人群的精子功能状况，是一个评价精子质量和预测生育能力的指标。 我们对在本院孕前检查中发现的精索静脉曲张患者进行了精浆生化和精子DNA 完整性检测，并对不同曲张程度患者的检测结果进行了对比分析，现报告如下。

资料与方法

一、对象及分组

所有对象均来自本院男性孕前检查门诊， 纳入标准：身体健康，无烟酒等不良嗜好，无高温、放射线、辐射、农药及其他化学毒物接触史；排除标准：无精子症、严重少精子症、精液液化异常、内分泌异常、睾丸外伤、生殖道炎症、病原微生物感染、其它可能影响精浆生化检测结果的疾病等。生殖系统检查发现有VC 者140 例为VC 组；对照组106 例为体检无VC 者，两组间年龄无显著性差异；VC 组按Valsalva 法分度，Ⅰ度60 例为VCⅠ组，Ⅱ度51 例为VCⅡ组，Ⅲ度29 例为VCⅢ组，双侧VC 者以较重一侧为准，三组间年龄无显著性差异。

二、检测项目及方法

禁欲4-7 天[1]，手淫法充分射精于一次性采精杯内，要求标本必须留取完整， 置37℃水浴箱内待其自然液化后进行各项检测。 所有试剂均购自深圳博锐德生物科技有限公司，按试剂盒内说明书进行各项操作。

（一）精子DNA 完整性检测：精子DNA 完整性检测用染色质扩散法（sperm chromatin dispersion，SCD），计算精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）。

（二） 精浆生化检测： 精液标本经4000r/min 离心15min 后分离精浆，进行精浆生化检测。 精浆锌（seminal plasma zinc，Zinc）定量检测用5-Br-PAPS 显色法；精浆果糖（seminal plasma fructose，FRU）定量检测用酶法；精浆α-葡萄糖苷酶（seminal plasma α-glucosidase，α-GLU）定量检测用改良Cooper 法； 精浆酸性磷酸酶（seminal plasma acid phosphatase，ACP）检测用对硝基酚磷酸法。

三、统计学处理

所有数据均录入电脑， 采用SPSS20.0 软件包处理分析数据。 正态性检验采用Shapiro Wilk 检验，方差齐性检验采用Levene 检验，所有数据均呈正态分布，且方差齐性；两组均数比较用t 检验，三组间均数比较用单因素方差分析，三组间两两比较用SNK 法，以P＜0.05为差异显著，有统计学意义。

结 果

一、VC 组和对照组间精浆生化、DFI 均数比较

与对照组相比，VC 组患者精浆α-GLU 明显降低（t=2.819，P ＜0.05）， 精 子DFI 明 显 升 高（t=12.476，P＜0.001）；两组间精浆Zinc、ACP、FRU 无显著性差异（t=1.401，P ＞0.05；t=1.018，P ＞0.05；t=0.742，P ＞0.05）（表1）。

表1 VC 组和对照组精浆生化、DFI 均数比较

二、VC 各组间精浆生化、DFI 均数比较

VC 组中，随着VC 曲张程度加重，精浆α-GLU 明显降低（F=18.469，P＜0.05），三组两两间比较有显著性差异（P＜0.05）；随着VC 曲张程度加重，精子DFI 明显升高（F=61.127，P＜0.001），三组两两间比较有显著性差异 （P＜0.05）；VC 各组间精浆Zinc、ACP、FRU 无显著性差异（F=3.874，P＞0.05；F=2.958，P＞0.05；F=1.786，P＞0.05）（表2）。

表2 VC 各组间精浆生化、DFI 均数比较

讨 论

VC 是男性常见的泌尿外科疾病，与男性不育关系密切。 VC 导致男性不育的机制复杂，至今尚未完全明确。 我们对在本院孕前检查男性中发现的精索静脉曲张患者进行了精浆生化和精子DNA 完整性检测，以探讨VC 对男性附性腺功能以及精子DNA 损伤的影响。因禁欲时间对精浆α-GLU 的活性有显著影响， 禁欲4～7d 的精浆α-GLU 活性比较稳定， 显著高于禁欲2～3d 的精浆α-GLU 活性[1]，故本研究受检者禁欲时间采用4～7d。

目前氧化应激学说被认为是VC 导致不育的重要机制之一。 氧化应激是指当氧化物在数量上超过抗氧化物，形成氧化产物以及这些现象引起的病理效应。 活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是指一大类能够引起氧化应激反应的物质，包括H2O2及外周轨道上含有未配对电子的不稳定自由基，如羟自由基、超氧阴离子、 氮自由基等。 总抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC) 是指存在于人体中所有对抗ROS 的能力，包括过氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等诸多抗氧化物。 正常生理状态下，ROS 和TAC 水平在男性生殖系统中保持着平衡状态， 在调节正常生精过程、精子运动、获能、顶体反应、精卵融合等方面起着重要的作用。 如果ROS 产生过多而TAC 能力下降，氧化程度超过机体清除能力，体内氧化/还原系统之间的平衡被破坏，就产生了氧化应激反应，引起脂质过氧化损伤精子膜，损害生精细胞和精子的抗氧化防御措施，最终导致精子受损、男性不育。

VC 时由于血睾屏障受损、血流微循环障碍、局部内环境缺氧，细胞在缺氧环境下进行无氧酵解，大量分解ATP， 其分解产物次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下产生大量ROS[2]，过量的ROS 超过了机体的氧化平衡能力时，启动了细胞膜脂质的过氧化，进而生成了大量的脂质过氧化物，对精子质膜进行攻击，致使生精细胞及精子DNA 单链、双链发生断裂，破坏了精子DNA 的完整性[3]。已有研究[4]发现VC 不育患者精子DNA 损伤水平以及氧化应激程度较高，导致DFI 升高，且VC 不育患者精浆ROS 水平与DFI 呈显著正相关关系[5]。 动物实验发现[6]，VC 大鼠睾丸组织匀浆中SOD、CAT 活性下降，并且临床已证实[7]VC 患者精浆TAC 水平下降，说明VC 时生殖系统抗氧化能力下降，意味着对ROS清除能力下降，体内氧化/ 还原系统之间失衡加剧，精子DNA 损伤加重。在本研究中，我们发现VC 组DFI 明显高于对照组，有统计学显著性差异（t=12.476，P＜0.001），证实VC 的确能引起精子DNA 损伤。 我们认为，正是由于VC 患者体内ROS 过度生成， 并且同时伴有抗氧化能力下降，这两方面因素共同作用的结果导致了VC患者DFI 明显升高，而DNA 损伤反过来也可诱导ROS的产生，两者相互作用、相互促进，最终导致机体进一步的氧化损伤。

8- 羟基脱氧鸟苷 (8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG)作为脂质过氧化反应的产物，可对机体出现的过氧化反应程度以及机体内ROS 生成程度进行有效反应，其水平的高低可对精子质膜产生影响，从而影响到精子质量。 康然[8]等研究发现，随着VC 曲张程度的加重，患者的8-OHdG 水平呈逐渐升高趋势，说明随着VC 曲张程度的加重体内氧化应激反应逐步加重；而谢胜[9]等通过对VC 不育患者精浆TAC 水平检测，证实随着VC 曲张程度越重，其TAC 水平越低，机体抗氧化能力逐步下降。 这就导致了随着VC 曲张程度的加重，患者的DNA 损伤严重程度也越来越高。 本研究探讨了不同曲张程度与DFI 之间的关系， 发现随着曲张严重程度的增加DFI 逐步升高（F=61.127，P＜0.001），三组两两间比较也具有显著性差异（P＜0.05），提示VC 与精子DNA 损伤可能存在线性关系，即VC 曲张严重程度越严重，精子DNA 损伤越严重。

精浆是精子赖以存活的载体，主要由前列腺、精囊腺、附睾和尿道球腺等腺体的分泌物组成，一旦这些腺体功能发表改变，即可能不同程度地影响到精液质量。因此， 精浆生化检查对评估附属性腺的功能以及研究附属性腺对男性生育的影响有重要意义。 睾丸中产生的精子已经达到形态学上的成熟， 输送到附睾后获得了前向运动和受精能力。 精浆α-GLU 是反映附睾功能的指标之一，由附睾上皮细胞合成和分泌形成，可通过催化多糖或糖蛋白中的碳水化合物分解为葡萄糖，从而为精子基本代谢、成熟、获能、运动和受精提供能源。本研究结果显示，VC 组精浆α-GLU 明显低于对照组（t=2.819，P＜0.05）， 并且 随 着VC 曲 张 程 度 的 增 加α-GLU 含量明显下降（F=18.469，P＜0.05），三组两两间比较也具有显著性差异（P＜0.05），其原因可能由于附睾大部分血液循环与睾丸同源，VC 改变了附睾的血流动力学，引起附睾组织低氧、附睾组织细胞凋亡加速，最终导致附睾功能降低[10]。 还有研究发现[11]VC 可以通过氧化应激反应导致附睾上皮紧密连接蛋白ZO-1 表达下降引起附睾上皮损伤，是VC 导致附睾功能受损的重要位点。

精液中的Zinc 主要源自前列腺， 为前列腺的特征性产物，可间接反映前列腺的功能。精浆Zinc 是多种酶的辅酶，是维持精子功能活动的重要微量元素之一；精浆FRU 来自于精囊腺， 是由血液中葡萄糖在精囊中通过酶促转化而产生的单糖，是精子主要的糖类来源，可用于监测精囊和睾丸间质细胞的功能；精浆ACP 主要由前列腺腺管上皮细胞分泌， 主要作用是催化磷酸酯键水解， 在精液中含量的变化能反应前列腺的分泌功能，并有助于前列腺疾病的诊断。 本研究未能发现精浆Zinc、FRU、ACP 与VC 的关系，表明VC 可能不影响前列腺、精囊腺的功能。

由于本研究对象均来自孕前检查健康体检者，不同于以往研究中的不育患者， 因此可能存在一定的选择性偏倚，对研究结果可能会造成一定的影响。 但本研究结果仍提示VC 能引起附睾功能下降、 导致精子DNA 损伤，并且随着VC 曲张程度的加重，附睾功能下降越严重，精子DNA 的损伤也越严重。 目前手术是治疗精索静脉曲张的主要方法，但术后精子质量改善、配偶的怀孕率等情况仍不能令人满意。 结合本研究结果，我们认为VC 手术治疗后配合药物治疗，有利于调整附睾功能、降低氧化应激反应[12]，从而改善患者的精子质量，提高生育力。